簡要描述:亞硝酸還原酶(NiR)測試盒 亞硝酸還原酶(Nitrite reductase,NiR)試劑盒 上海牧榮生物科技有限公司專業(yè)實驗室產(chǎn)品.為客戶全面解決實驗、生產(chǎn)、開發(fā)需求,提供方便、快捷的服務。
詳細介紹
品牌 | 其他品牌 | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
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應用領域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),制藥 |
亞硝酸還原酶(NiR)測試盒
微量法100T/48S
注意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義
硝酸還原酶(NiR)是一類能催化亞硝酸鹽還原的酶,廣泛存在于微生物及植物體內(nèi),是自然界氮循環(huán)過程中的關鍵酶,可以將亞硝酸鹽降解為NO或NH3,從而減少環(huán)境中亞硝態(tài)氮的積累,降低因亞硝酸鹽累積而造成的對生物體的毒害作用。
測定原理
亞硝酸還原酶可將NO2—還原為NO,使樣品中參與重氮化反應生成紫紅色化合物的NO2—減少,即540nm處吸光值的變化可反映亞硝酸還原酶的活性。
需自備的儀器和用品
天平、研缽、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、水浴鍋、低溫離心機。
試劑的組成和配制
提取液:液體112mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體4mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加5mL蒸餾水溶解。
試劑三:液體5mL×1瓶,4℃保存。(如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解)
試劑四:液體10mL×1瓶,4℃避光保存。(如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解)
試劑五:液體10mL×1瓶,4℃避光保存。
工作液:臨用前根據(jù)用量將試劑四和試劑五以1:1的比例混合。
酶液提取
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2.細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g,4℃離心10min,取上清置于冰上待測。
測定操作表
空白管 | 對照管 | 測定管 | |
樣本(μL) | 20 | 20 | |
蒸餾水(μL) | 20 | 40 | |
試劑一(μL) | 40 | 40 | |
試劑二(μL) | 40 | 40 | 40 |
混勻后,25℃反應1h | |||
試劑三(μL) | 40 | 40 | 40 |
充分震蕩30S | |||
上清液(μL) | 70 | 70 | 70 |
工作液(μL) | 140 | 140 | 140 |
充分混勻,,靜置3min后測定各管540nm處吸光值,分別記為A空白管、A對照管、A測定管??瞻坠苤灰鲆还?,每個測定管需設一個對照管。 |
計算公式
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準曲線:y = 1.3594x + 0.0072,R2 = 0.9997;x為標準品濃度(μmol/mL),y為吸光值(A標準管-A空白管)。
1.按照蛋白含量計算
酶活單位定義:每毫克組織蛋白每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR(μmol/h /mg prot)= [A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷1.3594×V標÷(V樣×Cpr)÷T = 1.47×(A空白管-A測定管+A對照管-0.0072)÷Cpr
2. 按照樣本質(zhì)量計算
酶活單位定義:每克組織每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR(μmol/h/g 鮮重)=[A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷1.3594×V標÷(W ×V樣÷V樣總)÷T = 1.47×(A空白管-A測定管+A對照管-0.0072)÷W
3. 按照細胞數(shù)量計算
酶活單位定義:每104個細胞每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR(μmol/h /104 cell)= [A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷1.3594×V標÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T = 1.47×(A空白管-A測定管+A對照管-0.0072)÷細胞數(shù)量
V標:標準液體積,0.04mL;V樣:體系中加入樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,1h; Cpr:樣本蛋白含量;W:樣本質(zhì)量,g
b. 使用96孔板測定的計算公式如下
標準曲線:y = 0.6797x + 0.0072,R2 = 0.9997;x為標準品濃度(μmol/mL),y為吸光值(A標準管-A空白管)。
1.按照蛋白含量計算
酶活單位定義:每毫克組織蛋白每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR(μmol/h /mg prot)= [A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷0.6797×V標÷(V樣×Cpr)÷T = 2.94×(A空白管-A測定管+A對照管-0.0072)÷Cpr
2. 按照樣本質(zhì)量計算
酶活單位定義:每克組織每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR(μmol/h/g 鮮重)=[A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷0.6797×V標÷(W ×V樣÷V樣總)÷T = 2.94×(A空白管-A測定管+A對照管-0.0072)÷W
3. 按照細胞數(shù)量計算
酶活單位定義:每104個細胞每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR(μmol/h /104 cell)= [A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷0.6797×V標÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T = 2.94×(A空白管-A測定管+A對照管-0.0072)÷ 細胞數(shù)量
V標:標準液體積,0.04mL;V樣:體系中加入樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,1h; Cpr:樣本蛋白含量;W:樣本質(zhì)量,g
注意事項
配制好的工作液3天內(nèi)使用完。
若吸光值超過1.5,將上清液進行適當?shù)南♂尯笤偌尤牍ぷ饕猴@色,并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
嚴格控制顯色時間,否則會對結果有影響。
標準曲線線性范圍為0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。
A空白管-(A測定管-A對照管)線性范圍為0.02-1.5。
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