簡要描述:丙酮酸激酶(PK)測(cè)試盒 丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)試劑盒上海牧榮生物科技有限公司專業(yè)實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品.
詳細(xì)介紹
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應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),制藥 |
丙酮酸激酶(PK)測(cè)試盒
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義
PK(EC 2.7.1.40)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,催化糖酵解過程中的最后一步反應(yīng),是糖酵解過程中的主要限速酶之一,也是產(chǎn)生ATP的關(guān)鍵酶之一,因此測(cè)定PK活性具有重要意義。
測(cè)定原理
PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸,乳酸脫氫酶進(jìn)一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+,在340nm下測(cè)定NADH下降速率,即可反映PK活性。
需自備的儀器和用品
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水
試劑的組成和配制
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體20mL×1瓶,4℃保存;;
試劑二:粉劑×2瓶,-20℃保存;
試劑三:液體10μL×2支,4℃保存;
樣本的前處理
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
3、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟
分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。
樣本測(cè)定
(1)試劑二的配制:臨用前取試劑二一瓶,加入9mL試劑一和1.06mL蒸餾水充分溶解,置于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴5min;現(xiàn)配現(xiàn)用。
(2)試劑三的配制:臨用前取試劑三一支,加入0.6mL蒸餾水充分溶解待用;現(xiàn)配現(xiàn)用。
(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三和180μL試劑二,混勻,立即記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A(chǔ)1和 2min20s后的吸光值A(chǔ)2,計(jì)算ΔA=A1-A2。
PK活性計(jì)算
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、血清(漿)中PK活力的計(jì)算:
單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PK(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=1608×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PK活力的計(jì)算:
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PK(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PK(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PK(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.216×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、血清(漿)中PK活力的計(jì)算:
單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PK(nmol/min /mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=3216×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PK活力的計(jì)算:
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PK(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PK(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PK(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.432×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
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