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β半乳糖苷酶(βGAL)測(cè)試盒

簡(jiǎn)要描述:β半乳糖苷酶(βGAL)測(cè)試盒,β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase, β-GAL)試劑盒上海牧榮生物科技有限公司專業(yè)實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品

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  • 更新時(shí)間:2024-05-06
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β半乳糖苷酶(βGAL)測(cè)試盒


正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

β-GAL(EC 3.2.1.23)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,能夠催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷鍵水解,此外還具有轉(zhuǎn)半乳糖苷的作用。β-GAL不僅可為植物的快速生長(zhǎng)釋放儲(chǔ)存的能量,還能在正常的多糖代謝、細(xì)胞壁組分代謝以及衰老時(shí)細(xì)胞壁降解過(guò)程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖殘基的水解,釋放自由的半乳糖。

測(cè)定原理:

β-GAL分解對(duì)-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成對(duì)-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率來(lái)計(jì)算β-GAL活性。

自備用品:

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前加入2.5mL蒸餾水,充分溶解備用;用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二:液體4mL×1瓶,4℃保存。

試劑三:液體13mL×1瓶,4℃保存。

粗酶液提?。?/p>

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);15000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

3、培養(yǎng)液等液體樣本:直接檢測(cè)

測(cè)定步驟:

  1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至400nm,蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定(在EP管或96孔板中依次加入下列試劑):

試劑名稱(μL)

測(cè)定管

對(duì)照管

試劑一

25


蒸餾水


25

試劑二

35

35

樣本

10

10

迅速混勻,放入37℃保溫30min

試劑三

130

130

充分混勻, 400nm處測(cè)定吸光值A(chǔ),計(jì)算ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。


β-GAL活性計(jì)算:

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.00585x -0.0027;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(nmol/mL),y為吸光值。

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

β-GAL活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算:

單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

β-GAL活性(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

β-GAL活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=0.08×(ΔA +0.0027)

(4)按液體體積計(jì)算:

單位的定義:每mL樣本每分鐘產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

β-GAL活性(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反總]÷V樣÷T

=39.89×(ΔA+0.0027)

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.07mL;V樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g; 500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬(wàn);T:反應(yīng)時(shí)間,30min。


b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.0039x -0.0027;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(nmol/mL),y為吸光值。

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

β-GAL活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=59.83×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算:

單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

β-GAL活性(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=59.83×(ΔA+0.0027) ÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

β-GAL活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=0.12×(ΔA +0.0027)

(4)按液體體積計(jì)算:

單位的定義:每mL樣本每分鐘產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

β-GAL活性(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V反總]÷V樣÷T

=59.83×(ΔA+0.0027)

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.07mL;V樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g; 500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬(wàn);T:反應(yīng)時(shí)間,30min。

上海牧榮生物科技有限公司

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β半乳糖苷酶(βGAL)測(cè)試盒


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