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染料聚集

更新時間:2023-05-16      點(diǎn)擊次數(shù):972

通過吸收光,染料分子進(jìn)入電子激發(fā)狀態(tài)。在這種情況下,吸收的能量僅存儲很短的時間,并在激發(fā)態(tài)的生命周期后再次輻射,例如熒光。

在染料溶液中,激發(fā)的染料分子(可視為點(diǎn)偶極子或振蕩器)如果它們之間的距離足夠大,則不會相互影響。因此,集合中存在的發(fā)色團(tuán)的吸收和熒光不會改變。

在發(fā)色團(tuán)之間的平均距離約為5-10nm處,影響僅通過振蕩器的“輻射場"發(fā)生,即沒有直接接觸。例如,通過染料分子的模型證明了兩個染料分子之間的這種相互作用。 福斯特共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 描述。

如果發(fā)色團(tuán)之間的距離變得更小,例如在非常濃縮的溶液中,由于各個振蕩器的靜電力,可能會產(chǎn)生強(qiáng)烈的相互影響。由于單個染料分子的分子間相互作用,這種染料溶液的吸收和熒光行為都發(fā)生了很大變化。


羅丹明6G水中
在羅丹明6G濃水溶液的紫外/可見光譜中,可以在主吸收帶的短波側(cè)觀察到肩部的外觀。如果通過稀釋溶液來改變濃度(c),并以相同的方式增加比色皿的層厚(d),以便根據(jù)朗伯-比爾定律始終可以期望相同的吸光度,則可以發(fā)現(xiàn)以下過程:



等吸點(diǎn)的出現(xiàn) - 所有涉及物質(zhì)的濃度變化是線性的,dE / dc = 0適用 - 表明兩個(或多個)物種正在以定義的方式相互轉(zhuǎn)化或彼此平衡。因此,這是一個動態(tài)平衡。



解離或二聚化常數(shù)可以通過實(shí)驗(yàn)確定:在稀釋系列中,溶液的稀釋總是由層厚度的變化補(bǔ)償,“有效消光系數(shù)"可以通過在了解稀釋因子和重量濃度的情況下(單體)最大值處測量的吸光度來計算。重量濃度由不發(fā)生二聚化的高度稀釋溶液的紫外光譜確定。由于朗伯-比爾定律中的單個吸收具有相加性,因此可以用反應(yīng)方程或.dem質(zhì)量作用定律來表示有效吸光度或有效消光系數(shù)。 通過解離常數(shù)的參數(shù)變化和合適的圖形繪制,最終得到一條直線,從其斜率和截距中可以確定單體和二聚體的消光系數(shù)。

疏水相互作用
有機(jī)染料的聚集尤其發(fā)生在具有高離子強(qiáng)度的水或溶劑中。主要原因是分子間范德華力:通過所謂的“疏水相互作用",親脂性分子試圖“逃避"親水性水分子,即為水合物殼提供盡可能小的表面積。這種現(xiàn)象還導(dǎo)致玻璃表面上的染料或基底分子上的非特異性鍵的吸附。

形成二聚體或更高聚集體的趨勢取決于

- 染料的濃度 – 濃度越高,聚集性越強(qiáng)
- 溶劑 – 與乙醇或其他有機(jī)溶劑相比,通??梢栽谒蚣状贾杏^察到聚集。通過比較等濃度溶液的吸收光譜,這一點(diǎn)令人印象深刻地證明了這一點(diǎn) 阿托 565 在含三氟yi酸(TFAc)的水性PBS緩沖液(pH 7.4)和乙醇中:


-也許 存在電解質(zhì) (鹽析),特別是當(dāng)離子對出現(xiàn)在有機(jī)溶劑(如氯仿)中時
- 溫度 – 在較高溫度下,熱運(yùn)動使聚集變得更加困難
- 分子 染料的結(jié)構(gòu) – 具有親水基團(tuán)的染料,例如 阿托 488, 阿托 532, 阿托 542 等,與疏水染料相反,例如 ATTO Rho6G, ATTO Rho11, ATTO Rho12 等。在水溶液中無聚集:


 

由于它是動態(tài)平衡 - 如上所述 - 二聚體可以通過稀釋溶液轉(zhuǎn)化為單體。當(dāng)測量的吸收光譜不再隨著進(jìn)一步稀釋和層厚度的相應(yīng)增加而變化時,達(dá)到“單體光譜"。適用于大多數(shù)疏水性 阿托-這是吸光度約為0.04(層厚1cm;c = 10-7 – 10-6 摩爾/升)。




蛋白質(zhì)偶聯(lián)物中的分子內(nèi)相互作用/DOL測定
當(dāng)染料NHS酯與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)時,可以形成染料偶聯(lián)物,其中共價鍵合的染料分子緊密相鄰并且可以相互作用。這以同樣的方式表現(xiàn)為吸收光譜的強(qiáng)烈變化,正如在ATTO 565階親和素偶聯(lián)物的例子中可以清楚地看到的那樣:



在共軛光譜中觀察到一個額外的短波吸收帶,類似于具有足夠高濃度的水性染料溶液的“二聚體帶"。因?yàn)樵谶@種情況下它是 分子內(nèi) 共價鍵合染料分子的相互作用,吸收光譜通過稀釋共軛溶液而改變 不!
在這種情況下,標(biāo)簽程度(DOL)的確定在我們的工作規(guī)范中規(guī)定"蛋白質(zhì)標(biāo)記“的描述。


兩種形式的聚合之間有一個基本的區(qū)別:

H 聚集體 (H = 催眠致變色), 短波
當(dāng)兩個或多個染料分子以這樣的方式相互連接時,就會發(fā)生這種類型的聚集,即它們的過渡偶極矩(在 S 的情況下0 – S1 過渡通常沿發(fā)色系統(tǒng)的縱軸運(yùn)行)彼此平行。與單體吸收相反,觀察到一個半致變色的吸收帶。

由于空間接近,電子結(jié)構(gòu)相互影響,可以說兩個分子必須一起考慮。能級被分裂,量子力學(xué)現(xiàn)在允許的吸收躍遷更有能量,因此波長更短。從這種較高的激發(fā)狀態(tài)開始,發(fā)生快速的內(nèi)部轉(zhuǎn)換(IC),從而使熒光被淬滅。




J 單位(根據(jù) E.E. Jelley),長波
在這種類型的聚集中,獲得吸收帶的長波偏移,這與帶的半寬顯著減小有關(guān)。

J-聚集體通常存在于聚甲胺染料中,例如花青、亞菁或類似的發(fā)色團(tuán)。Jelley和Scheibe使用染料假異氰素獨(dú)立地觀察了這一現(xiàn)象。對于由單個染料聚集形成的“超分子聚合物"的模型描述,已經(jīng)提出了各種類型。對分子關(guān)系簡單的描述是單個分子一個接一個地排列自己,因此過渡偶極矩也在同一條線上。對分子的共同考慮再次導(dǎo)致能級的分裂:量子力學(xué)允許的躍遷現(xiàn)在能量較低, 這解釋了吸收帶的長波偏移。



聚集會受到溶劑成分、鹽或其他物質(zhì)的添加以及濃度的強(qiáng)烈影響。在理想條件下,所述極窄的吸收帶可以在紫外/可見光譜中找到。此外,與H聚集體相比,可以在這里觀察到熒光,特別是在較低的溫度下: 然而,發(fā)射帶的最大值也非常窄,僅比吸收最大值長幾納米。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件,文獻(xiàn)中還描述了吸收帶的“展寬",除其他外,通過包含J聚集體的禁止電子轉(zhuǎn)移來解釋。

ATTO 488 標(biāo)記的磷脂
解決方案來自 阿托 488 標(biāo)記的磷脂 純氯仿最初令人驚訝,因?yàn)樗鼈兙哂幸庀氩坏降念伾衡g溶液不是帶有亮綠色熒光的淺黃色,而是呈粉紅色至品紅色。吸收的長波偏移可以通過J-聚集體的存在來解釋。當(dāng)所討論的溶液用甲醇稀釋時,顏色變?yōu)橥ǔ5狞S色陰影,并且可見強(qiáng)烈的熒光。通過改變?nèi)軇┙M成,聚集體被推回。
下圖顯示了 阿托 488 選擇 1,2-二棕櫚?;?-純氯仿和氯仿/甲醇溶劑混合物中的甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)(8:2,v/v):

 


在左側(cè),兩種解決方案都在正常日光下顯示。在右側(cè),當(dāng)用紫外光(366nm)照射時,可以特別清楚地看到甲醇混合溶液的綠色熒光。


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