轉(zhuǎn)染是一種常見的實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),用于許多研究領(lǐng)域、藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)。 體外轉(zhuǎn)染是指將貨物分子(例如核酸 – DNA或RNA)輸送到培養(yǎng)的細(xì)胞(通常是癌細(xì)胞系)中。 體內(nèi) 轉(zhuǎn)染是指將貨物分子(如治療性 siRNA、質(zhì)粒 DNA、小蛋白等)遞送至靶組織。有針對(duì) 體外 和 體內(nèi) 轉(zhuǎn)染優(yōu)化的市售轉(zhuǎn)染產(chǎn)品,以及生物 CRO 提供的轉(zhuǎn)染服務(wù)經(jīng)過 GLP 認(rèn)證,可以根據(jù) FDA 的要求進(jìn)行這些臨床前實(shí)驗(yàn)。
轉(zhuǎn)染方法包括通過非病毒技術(shù)進(jìn)行的各種方法(物理和化學(xué)方法)——電穿孔、磷酸鈣暴露、基于脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染,允許通過細(xì)胞膜遞送貨物分子而不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成長久的損傷。下面描述了幾種化學(xué)轉(zhuǎn)染方法。
化學(xué)轉(zhuǎn)染方法
由于可供購買的轉(zhuǎn)染試劑簡(jiǎn)單、成本高且種類繁多,化學(xué)轉(zhuǎn)染是一種流行的技術(shù)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染通常用于持續(xù)數(shù)天的所需基因的短期表達(dá)。研究應(yīng)用包括基因表達(dá)研究、基因沉默研究和重組蛋白分析。
化學(xué)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的工作流程在各種細(xì)胞類型中都很常見。這包括在亞匯合處接種細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染前立即制備轉(zhuǎn)染試劑/DNA 復(fù)合物,然后評(píng)估構(gòu)建體的表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)基在接種細(xì)胞后一天更新,然后在轉(zhuǎn)染后幾小時(shí)更新。必須對(duì)轉(zhuǎn)染方案進(jìn)行優(yōu)化,以確保高轉(zhuǎn)染效率,并且該方法對(duì)被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無毒。
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是使用脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染,脂質(zhì)體是可以與細(xì)胞膜融合并能夠釋放其內(nèi)容物的小分子。脂質(zhì)體可以是基于脂質(zhì)的(更常見),也可以是基于非脂質(zhì)的。帶正電荷的陽離子聚合物與帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合良好,是另一種轉(zhuǎn)染方法。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法在新藥發(fā)現(xiàn)和開發(fā)中有多種常見應(yīng)用,尤其是在腫瘤學(xué)中,其中的應(yīng)用包括通過基于小分子的藥物靶向特定基因(例如致癌基因)或使用 RNAi 技術(shù)進(jìn)行基因沉默。
物理轉(zhuǎn)染方法
電穿孔和細(xì)胞注射(例如基因槍)是物理轉(zhuǎn)染方法的兩個(gè)經(jīng)典例子,它們能夠完成核酸的遞送,但由于細(xì)胞膜的破壞而對(duì)細(xì)胞很苛刻并且經(jīng)常導(dǎo)致細(xì)胞死亡。對(duì)于傳統(tǒng)上難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來說,這是一個(gè)合適的選擇。物理轉(zhuǎn)染涉及電穿孔、顯微注射和基因槍粒子遞送。
電穿孔取決于 DNA 濃度和所用細(xì)胞的類型。傳統(tǒng)的電穿孔需要使用電穿孔比色皿。許多公司銷售的電穿孔系統(tǒng)與從原代細(xì)胞和干細(xì)胞到原核細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞類型兼容。
顯微注射通常用于將 DNA 和 RNA 引入單個(gè)細(xì)胞,例如胚胎干細(xì)胞。借助顯微操作器和顯微鏡,DNA 或 RNA 直接插入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。這通常很耗時(shí),但會(huì)產(chǎn)生非常高的轉(zhuǎn)染效率。
基因槍顆粒遞送依賴于攜帶核酸的微粒將 DNA 或 RNA 引入細(xì)胞。一種快速的方法,將這些顆粒射入細(xì)胞,但缺點(diǎn)是細(xì)胞死亡率很高。
轉(zhuǎn)染方案和實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)
雖然轉(zhuǎn)染是一種非常廣泛和有用的技術(shù),但它對(duì)被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型具有高度特異性。一些細(xì)胞更適合轉(zhuǎn)染,而另一些細(xì)胞則不適合,因此一些細(xì)胞對(duì)某些轉(zhuǎn)染試劑更敏感。細(xì)胞系的廣泛多樣性和與每個(gè)細(xì)胞系相關(guān)的具體細(xì)微差別需要一本教科書來充分描述,但值得慶幸的是,轉(zhuǎn)染試劑可以幫助實(shí)驗(yàn)發(fā)揮作用,而無需進(jìn)行廣泛的背景研究。許多公司開發(fā)了專門針對(duì)特定細(xì)胞類型優(yōu)化的轉(zhuǎn)染試劑,從而確?;蚓庉媽?shí)驗(yàn)的最大效率。
在設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí),了解轉(zhuǎn)染的最終目標(biāo)尤為重要;穩(wěn)定表達(dá)需要與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不同的設(shè)置,因此,應(yīng)調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案。如果時(shí)間緊迫,那么轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)可以外包給可靠的公司,這些公司可以保證為研究應(yīng)用開發(fā)穩(wěn)定或瞬時(shí)細(xì)胞系。
Altogen Biosystems 的體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑
RNAi 已用于使用動(dòng)物模型的體內(nèi)目標(biāo)驗(yàn)證研究。在體內(nèi)進(jìn)行 RNAi 研究的主要挑戰(zhàn)是將功能性小 RNA 分子有效、定向地遞送到特定組織中。 Altogen® In Vivo Transfection Reagents 可以與 siRNA(或 microRNA)結(jié)合,并通過瘤內(nèi) (it) 或通過靜脈 (iv) 尾靜脈注射進(jìn)行全身給藥,以在特定組織(包括肝臟、胰腺、腎臟和腫瘤。早在注射后 24 小時(shí)就可以看到選擇性擊倒。
Altogen Biosystems 的特色體內(nèi)轉(zhuǎn)染產(chǎn)品:
體內(nèi)納米顆粒轉(zhuǎn)染試劑盒 || 體內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑盒 || 體內(nèi)胰腺靶向轉(zhuǎn)染試劑盒
Altogen Custom Services 提供專業(yè)的生物技術(shù)和制藥服務(wù),包括60 多種經(jīng)過驗(yàn)證的異種移植模型、穩(wěn)定細(xì)胞系的開發(fā)、RNA 干擾 (RNAi) 服務(wù)、分析開發(fā)、ELISA 和蛋白質(zhì)印跡服務(wù)、siRNA 文庫篩選和轉(zhuǎn)染服務(wù)。穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的生成可能非常昂貴且耗時(shí)。Altogen Labs 提供僅需 28 天即可完成的穩(wěn)定細(xì)胞系生成服務(wù)。
轉(zhuǎn)染方法和細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)
細(xì)胞轉(zhuǎn)染是一種實(shí)驗(yàn)室技術(shù),用于將核酸(例如 DNA、RNA 或 siRNA)輸送到細(xì)胞中以修飾其基因表達(dá)或研究基因功能。該技術(shù)涉及使用轉(zhuǎn)染試劑將核酸引入細(xì)胞,這有助于它們進(jìn)入細(xì)胞。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染通常包括以下步驟:
轉(zhuǎn)染試劑的選擇:研究人員選擇與被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型和被遞送的核酸類型兼容的轉(zhuǎn)染試劑。
核酸的制備:通過從天然來源分離它們或在實(shí)驗(yàn)室中合成它們來制備核酸。
轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成:核酸與轉(zhuǎn)染試劑混合形成可進(jìn)入細(xì)胞的復(fù)合物。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞中,孵育細(xì)胞,使核酸進(jìn)入細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染效率分析:通過使用 PCR、蛋白質(zhì)印跡或熒光顯微鏡等技術(shù)測(cè)量遞送核酸的基因表達(dá)水平來評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染是研究基因功能和開發(fā)遺傳疾病或癌癥新療法的寶貴工具。然而,轉(zhuǎn)染的效率和特異性會(huì)受到多種因素的影響,包括轉(zhuǎn)染試劑的選擇、被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)條件。因此,仔細(xì)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件和適當(dāng)?shù)目刂茖?duì)于確保轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的可靠性和可重復(fù)性非常重要。