介紹
體外 轉(zhuǎn)染過程 涉及將遺傳物質(zhì)引入細(xì)胞,通常通過非病毒方法用于哺乳動物細(xì)胞 [1]。各種治療性貨物分子可用于細(xì)胞內(nèi)遞送至癌細(xì)胞系和原代細(xì)胞,包括質(zhì)粒 DNA (pDNA)、蛋白質(zhì)、小分子、信使 RNA (mRNA) 和RNA,例如短干擾 RNA ( siRNA ) 和微小 RNA (miRNA) ) [2]。Altogen Biosystems 通過將組合化學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)方面的專業(yè)知識應(yīng)用于轉(zhuǎn)染技術(shù)的開發(fā),為特定細(xì)胞系開發(fā)優(yōu)化的轉(zhuǎn)染技術(shù)。
自 1950 年代以來,轉(zhuǎn)染一直在使用,并且仍然是細(xì)胞生物學(xué)研究中的重要元素,其技術(shù)范圍從物理技術(shù)(如電穿孔)到使用磷酸鈣的化學(xué)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染,甚至脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù) [3]。在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染中,遺傳物質(zhì)包含在脂質(zhì)體中通過將材料與陽離子脂質(zhì)混合,脂質(zhì)體將其“貨物"沉積到靶細(xì)胞中。可以針對目標(biāo)細(xì)胞系優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑,也可以定制轉(zhuǎn)染方案。最近出現(xiàn)了幾種先進的方法,例如基于脂質(zhì)和聚合物的載體分子。這些化合物能夠產(chǎn)生脂質(zhì)體,脂質(zhì)體可以與細(xì)胞膜融合,以便將結(jié)合的 RNA 或 DNA 遞送至細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染:作用機制
體外 轉(zhuǎn)染是將外源分子和遺傳物質(zhì)、DNA或 RNA 瞬時或穩(wěn)定地引入培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中。盡管轉(zhuǎn)染技術(shù)存在方法學(xué)多樣性,但化學(xué)轉(zhuǎn)染是當(dāng)前實驗室研究中使用的技術(shù)。使用的轉(zhuǎn)染試劑含有陽離子脂質(zhì),有助于將 DNA 和 siRNA 遞送到細(xì)胞中 [4];雖然陽離子聚合物是最早使用的化學(xué)品之一,但陽離子脂質(zhì)現(xiàn)在是當(dāng)今使用廣泛的化學(xué)品。化學(xué)轉(zhuǎn)染背后的科學(xué)原理保持不變,它基于載貨分子與細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層之間的靜電相互作用. 基本上,帶負(fù)電荷的遺傳物質(zhì)與帶正電荷的試劑結(jié)合,使遺傳物質(zhì)能夠穿過細(xì)胞膜,從而通過內(nèi)吞作用發(fā)生細(xì)胞攝取。在細(xì)胞內(nèi)部,轉(zhuǎn)染復(fù)合物可用于多種目的。如果 DNA 被轉(zhuǎn)染,則穩(wěn)定表達需要它進入細(xì)胞核,從而導(dǎo)致基因表達 [5]。可能影響特定化學(xué)選擇的因素取決于轉(zhuǎn)染的遺傳物質(zhì),但 pH 值、細(xì)胞類型以及遺傳物質(zhì)與試劑的比例等因素對于正確的實驗設(shè)置至關(guān)重要。
轉(zhuǎn)染方法
將 DNA 和 RNA 引入培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞可能需要不同的轉(zhuǎn)染方法,具體取決于特定的細(xì)胞系和最終目標(biāo)。此類方法包括脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑(脂質(zhì)和聚合物)、基于樹枝狀聚合物的轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、病毒介導(dǎo)的基因遞送、RNA 干擾 (RNAi)、siRNA 轉(zhuǎn)染、高通量 siRNA 篩選和基因沉默 (RNAi) [6, 7, 8]。
轉(zhuǎn)染試劑
對于化學(xué)轉(zhuǎn)染實驗來說,保持細(xì)胞活力極為重要;如果細(xì)胞因用于轉(zhuǎn)染的有毒化學(xué)品而死亡,則實驗結(jié)束。轉(zhuǎn)染試劑之所以眾多,正是因為某些細(xì)胞類型需要更溫和的條件或特殊添加劑來防止細(xì)胞毒性。就此而言,Altogen Biosystems 提供了專為特定細(xì)胞系設(shè)計的種類齊全的試劑,專門設(shè)計用于提高轉(zhuǎn)染效率,同時防止細(xì)胞死亡。
轉(zhuǎn)染試劑本身由專門針對特定細(xì)胞類型優(yōu)化的緩沖液配方組成。在某些情況下,轉(zhuǎn)染試劑可包括旨在幫助所需化合物進入細(xì)胞的分子。例如,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將包括脂質(zhì)體鏈,其封裝給定的核酸序列并允許其被細(xì)胞內(nèi)吞。另一個例子是用納米粒子制成的轉(zhuǎn)染試劑,它可以結(jié)合所需的序列并幫助它們穿過細(xì)胞膜。
與所需貨物結(jié)合的轉(zhuǎn)染試劑和影響細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)染試劑之間應(yīng)該有一個重要的區(qū)別。例如,電穿孔緩沖液是一種轉(zhuǎn)染試劑,它允許細(xì)胞膜變得可滲透,從而允許外來顆粒進入細(xì)胞。然而,電穿孔緩沖液不封裝核酸序列,因此電穿孔實驗必須依賴轉(zhuǎn)染化合物的獨立穩(wěn)定性。
體外 轉(zhuǎn)染研究
Altogen Biosystems 提供針對不同細(xì)胞系優(yōu)化的不同體外轉(zhuǎn)染試劑,例如 A549 細(xì)胞(肺癌)、DU145 細(xì)胞(前列腺癌)、MCF-7 細(xì)胞(乳腺癌)和 HepG2 細(xì)胞(肝細(xì)胞癌)。以下是使用 細(xì)胞系特異性體外轉(zhuǎn)染試劑進行的幾項研究的數(shù)據(jù)匯編。
A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑(肺癌細(xì)胞,CCL-185)
圖 1.按照推薦方案轉(zhuǎn)染靶向 Lamin A/C mRNA 或非沉默對照 siRNA 的 siRNA。在轉(zhuǎn)染后 48 小時,通過 qRT-PCR 分析 A549 細(xì)胞的基因表達水平。18S rRNA 水平用于標(biāo)準(zhǔn)化 Lamin A/C 數(shù)據(jù)。將值歸一化為未處理的樣品。數(shù)據(jù)為平均值±SD (n=3)。
雙組分制劑提高了脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率,
為 RNA 和 DNA 的轉(zhuǎn)染提供了優(yōu)化的易于使用的轉(zhuǎn)染方案
血清存在下的高轉(zhuǎn)染效率
適用于標(biāo)準(zhǔn)反向轉(zhuǎn)染和高通量應(yīng)用。
試劑表現(xiàn)出至少 80% 的 siRNA 轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率通過實時RT-PCR確定。
圖 2. Lamin A/C 在 A549 細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達。按照 Altogen Biosystems 轉(zhuǎn)染方案,將表達 Lamin A/C 或靶向 Lamin A/C 的 siRNA 的 DNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 A549 細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后 72 小時,通過蛋白質(zhì)印跡分析細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達水平(通過總蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化,每孔加載 10 µg 總蛋白質(zhì))。未處理的細(xì)胞用作陰性對照。
DU145 細(xì)胞(前列腺癌細(xì)胞,HTB-81)轉(zhuǎn)染試劑
圖 3.按照推薦方案將靶向 Lamin A/C mRNA 或非沉默對照 siRNA 的 siRNA 轉(zhuǎn)染到 DU-145 細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后 48 小時,通過 qRT-PCR 分析細(xì)胞的 Lamin A/C 基因表達水平。18S rRNA 水平用于標(biāo)準(zhǔn)化 Lamin A/C 數(shù)據(jù)。將值歸一化為未處理的樣品。數(shù)據(jù)為平均值±SD (n=4)。
專有陽離子脂質(zhì)配方
小RNA(siRNA、shRNA、miRNA)、mRNA、pDNA的高轉(zhuǎn)染效率
產(chǎn)生一致的結(jié)果,批次到批次、板到板和孔到孔
一種經(jīng)過驗證的用于建立穩(wěn)定細(xì)胞系的試劑
優(yōu)化的轉(zhuǎn)染方案適用于標(biāo)準(zhǔn)和反向轉(zhuǎn)染方法。
有效且穩(wěn)健的細(xì)胞內(nèi)遞送
試劑盒包括轉(zhuǎn)染增強劑試劑
在血清存在下工作
試劑表現(xiàn)出至少 75% 的 siRNA 轉(zhuǎn)染效率。通過 qRT-PCR 確定轉(zhuǎn)染效率。
圖 4. Lamin A/C 在 DU145 細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達。按照 Altogen Biosystems 轉(zhuǎn)染方案,將表達 Lamin A/C 或靶向 Lamin A/C 的 siRNA 的 DNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 DU145 細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后 72 小時,通過蛋白質(zhì)印跡分析細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達水平(通過總蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化,每孔加載 10 µg 總蛋白質(zhì))。未處理的細(xì)胞用作陰性對照。
MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑(乳腺癌細(xì)胞,HTB-22)
圖 5 。在用靶向 GAPD 或非沉默 siRNA 的 siRNA 轉(zhuǎn)染的 MCF-7 細(xì)胞中,使用實時 RT-PCR 對 GAPD mRNA 水平進行量化。轉(zhuǎn)染后 48 小時,收獲細(xì)胞并通過實時 RT-PCR 分析 GAPDH mRNA 表達水平。數(shù)據(jù)針對 18S rRNA 信號進行標(biāo)準(zhǔn)化。對照樣品是模擬轉(zhuǎn)染的或未處理的。將值歸一化為未處理的樣品。數(shù)據(jù)為平均值±SD (n=3)。
專有陽離子脂質(zhì)配方
小RNA(siRNA、shRNA、miRNA)、mRNA、pDNA的高轉(zhuǎn)染效率
產(chǎn)生一致的結(jié)果,批次到批次、板到板和孔到孔
在血清存在下工作
一種經(jīng)過驗證的用于建立穩(wěn)定細(xì)胞系的試劑
試劑表現(xiàn)出至少 85% 的 siRNA 轉(zhuǎn)染效率。通過 qRT-PCR 確定轉(zhuǎn)染效率。
圖 6. MCF-7 細(xì)胞中 GAPDH 的蛋白表達。按照 Altogen Biosystems 轉(zhuǎn)染方案,將表達 GAPDH 或靶向 GAPDH 的 siRNA 的 DNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 MCF-7 細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后 72 小時,通過蛋白質(zhì)印跡分析細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達水平(通過總蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化,每孔加載 10 µg 總蛋白質(zhì))。未處理的細(xì)胞用作陰性對照。
HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑(肝癌細(xì)胞,HB-8065)
圖 7.在轉(zhuǎn)染了靶向 GAPD 或非沉默 siRNA 的 siRNA 的 HepG2 細(xì)胞中,使用實時 RT-PCR 對 GAPD mRNA 水平進行了定量。轉(zhuǎn)染后 48 小時,收獲細(xì)胞并通過實時 RT-PCR 分析 GAPDH mRNA 表達水平。數(shù)據(jù)針對 18S rRNA 信號進行標(biāo)準(zhǔn)化。對照樣品是模擬轉(zhuǎn)染的或未處理的。將值歸一化為未處理的樣品。數(shù)據(jù)為平均值±SD (n=3)。
小RNA(siRNA、shRNA、miRNA)、mRNA、pDNA的高轉(zhuǎn)染效率
有效且穩(wěn)健的細(xì)胞內(nèi)遞送
產(chǎn)生一致的結(jié)果,批次到批次、板到板和孔到孔
在血清存在下工作
一種經(jīng)過驗證的用于建立穩(wěn)定細(xì)胞系的試劑
試劑表現(xiàn)出至少 90% 的 siRNA 轉(zhuǎn)染效率。通過 qRT-PCR 確定轉(zhuǎn)染效率。
圖 8. HepG2 細(xì)胞中 GAPDH 的蛋白表達。按照 Altogen Biosystems 轉(zhuǎn)染方案,將表達 GAPDH 或靶向 GAPDH 的 siRNA 的 DNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 HepG2 細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后 72 小時,通過蛋白質(zhì)印跡分析細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達水平(通過總蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化,每孔加載 10 µg 總蛋白質(zhì))。未處理的細(xì)胞用作陰性對照。
結(jié)論:
轉(zhuǎn)染是一項經(jīng)過充分測試且至關(guān)重要的生物技術(shù),它使研究人員能夠直接在細(xì)胞中研究基因產(chǎn)物和基因功能。不同的轉(zhuǎn)染方法允許以非常特定的方式傳遞遺傳物質(zhì),從而使其成為臨床前生物學(xué)研究中極其通用的工具。選擇最佳方法涉及實施最佳轉(zhuǎn)染試劑,以及選擇最佳實驗設(shè)計。
Altogen Biosystems 提供預(yù)優(yōu)化和細(xì)胞系特異性體外轉(zhuǎn)染試劑和試劑盒。在他們的網(wǎng)站上了解更多關(guān)于這些轉(zhuǎn)染試劑和試劑盒的信息,并加快您今天的臨床前生物學(xué)研究。