乙酰膽堿酯酶（AchE）測試盒

注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

AchE屬于絲氨酸水解酶，廣泛存在于各種動物組織和血清中。AchE催化乙酰膽堿（Ach）水解，在神經(jīng)傳導調(diào)節(jié)中起重要作用。

測定原理：

AchE催化Ach水解生成膽堿，膽堿與二硫?qū)ο趸郊姿幔―TNB）作用生成5-巰基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB在412nm處有吸收峰，通過測定412 nm吸光度增加速率，計算AchE活性。

自備儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1支，4℃保存。臨用前加入1.3 mL試劑二，充分震蕩溶解。

試劑四：粉劑×1支，4℃保存。臨用前加入1.3 mL試劑二，充分震蕩溶解。

粗酶液提取：

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿，8000g 4℃離心10min，取上清液待測。

細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

血清等液體：直接測定。

測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min，調(diào)節(jié)波長到412 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于37℃水浴中預熱30min。

3. 取微量石英比色皿/96孔板，依次加入20μL上清液、160 μL試劑二、10μL試劑三和10μL試劑四，迅速混勻，于412nm處測定3min內(nèi)吸光值變化，第10s吸光值記為A1，第190s吸光值記為A2?！鰽測定管=A2-A1。

AchE活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

組織AchE活性

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位。

AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反總×109)÷（Cpr ×V樣）÷T

= 245×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位。

AchE酶活(nmol/min/g 鮮重)= (△A÷ε÷d×V反總×109)÷（W ×V樣÷V樣總）÷T

= 245×△A÷W

細菌、細胞AchE活性

活性單位定義：每104個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位。

AchE酶活(nmol/min/104 cell)= (△A÷ε÷d×V反總×109)÷（細胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T

= 245×△A÷細胞數(shù)量

血清AchE活性

活性單位定義：每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位。

AchE酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V反總×109)÷V樣÷T

=245×△A

ε：TNB摩爾消光系數(shù)，13.6×103 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應體系總體積（L），200μL=2×10-4L；V樣總：提取液體積，1 mL；106：1mol=1×106μmol；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）；V樣：加入上清液體積（mL），0.02 mL；W ：樣品質(zhì)量；T：反應時間（min），3 min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

1. 組織AchE活性

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位。

AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反總×109)÷（Cpr ×V樣）÷T

= 490×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位。

AchE酶活(nmol/min/g 鮮重)= (△A÷ε÷d×V反總×109)÷（W ×V樣÷V樣總）÷T

= 490×△A÷W

2. 細菌、細胞AchE活性

活性單位定義：每104個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位。

AchE酶活(nmol/min/104 cell)= (△A÷ε÷d×V反總×109)÷（細胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T

= 490×△A÷細胞數(shù)量

3. 血清AchE活性

活性單位定義：每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位。

AchE酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V反總×109)÷V樣÷T

=490×△A

ε：TNB摩爾消光系數(shù)，13.6×103 L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應體系總體積（L），200μL=2×10-4L；V樣總：提取液體積，1 mL；106：1mol=1×106μmol；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）；V樣：加入上清液體積（mL），0.02 mL；W ：樣品質(zhì)量；T：反應時間（min），3 min。

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