交聯(lián)劑包含至少兩個反應(yīng)性基團(tuán),它們對包括巰基和胺在內(nèi)的許多基團(tuán)具有反應(yīng)性,并在兩個或多個分子之間產(chǎn)生化學(xué)共價鍵??捎媒宦?lián)劑靶向的官能團(tuán)是伯胺、羧基、巰基、碳水化合物和羧酸。蛋白質(zhì)分子具有許多這樣的官能團(tuán),因此蛋白質(zhì)和肽可以使用交聯(lián)劑容易地結(jié)合。交聯(lián)劑用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能,將蛋白質(zhì)錨定在固體支持物上,制備免疫原、免疫毒素和其他結(jié)合的蛋白質(zhì)試劑。
交聯(lián)劑可以根據(jù)反應(yīng)性基團(tuán)的數(shù)量和相似性分成幾組:
• 同雙功能具有兩個相同的反應(yīng)端。
• 異雙功能具有兩個不同的反應(yīng)端。
同雙官能交聯(lián)劑用于一步反應(yīng),而異雙官能交聯(lián)劑用于兩步連續(xù)反應(yīng),其中最不穩(wěn)定的反應(yīng)末端首先反應(yīng)。同雙官能交聯(lián)劑具有導(dǎo)致自結(jié)合、聚合和細(xì)胞內(nèi)交聯(lián)的趨勢。另一方面,異雙官能試劑允許更可控的兩步反應(yīng),這使得不希望的分子內(nèi)交叉反應(yīng)和聚合反應(yīng)最小化。
廣泛使用的異雙功能交聯(lián)劑用于通過胺和巰基偶聯(lián)蛋白質(zhì)。最不穩(wěn)定的胺反應(yīng)性NHS-酯首先偶聯(lián),在除去未偶聯(lián)的試劑后,繼續(xù)偶聯(lián)巰基。巰基反應(yīng)基團(tuán)通常是馬來酰亞胺、吡啶基二硫化物和α-鹵代乙酰基。其他交聯(lián)劑包括碳二亞胺,它連接羧基(-COOH)和伯胺(-NH2)。存在具有一個光反應(yīng)性末端的異雙官能交聯(lián)劑。光反應(yīng)性基團(tuán)在沒有特定基團(tuán)可與之反應(yīng)時使用,因為光反應(yīng)性基團(tuán)在暴露于紫外光時會發(fā)生非特異性反應(yīng)。
通常希望最小化由于交聯(lián)反應(yīng)引起的結(jié)構(gòu)變化的程度,如果蛋白質(zhì)分子具有生物活性則更是如此。因此,交聯(lián)是在溫和的緩沖液和pH條件下進(jìn)行的。根據(jù)應(yīng)用,結(jié)合程度也很重要,并且必須保持最佳的交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)的比例。蛋白質(zhì)外表面上目標(biāo)基團(tuán)的數(shù)量也很重要。如果暴露的目標(biāo)基團(tuán)易于結(jié)合;可以使用較低的交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)的比率。
交聯(lián)劑具有不同的間隔臂長度。當(dāng)兩個目標(biāo)基團(tuán)相距較遠(yuǎn)時,可以使用具有較長間隔臂的交聯(lián)劑。具有不同間隔臂的交聯(lián)劑的可用性使得交叉反應(yīng)效率更優(yōu)化。具有短間隔臂的交聯(lián)劑適用于分子內(nèi)交聯(lián)??汕懈畹慕宦?lián)劑也是可用的,這擴(kuò)展了蛋白質(zhì)分析的范圍。
蛋白質(zhì)交聯(lián)劑的選擇
當(dāng)選擇交聯(lián)劑時,要考慮以下特征:
1.試劑溶解度
2.反應(yīng)基團(tuán)的性質(zhì)
3.同雙功能或異雙功能
4.光反應(yīng)性或熱反應(yīng)性基團(tuán)
5.間隔臂的長度
6.共軛產(chǎn)物可裂解與否
7.進(jìn)一步標(biāo)記的可能性
8.結(jié)合所需的反應(yīng)條件
Double Do交聯(lián)劑
G-Biosciences提供多種交聯(lián)劑作為Double Do交聯(lián)劑。Double Do交聯(lián)劑系列產(chǎn)品包括化學(xué)交聯(lián)劑、由特定反應(yīng)緩沖液組成的支持附件、完整的反應(yīng)系統(tǒng)、選擇指南和方案。
為了選擇交聯(lián)劑,需要考慮幾個因素:
• 反應(yīng)方向:確定要交聯(lián)的目標(biāo)殘基,選擇不干擾蛋白質(zhì)功能的試劑。
• 膜滲透性:對于細(xì)胞表面標(biāo)記,選擇非膜滲透性試劑。
• 劈得開的:便于從固體支持物上釋放交聯(lián)蛋白或用于進(jìn)一步的下游應(yīng)用。
• 可逆的:可裂解試劑的替代物是可逆試劑。例如,ANB-NOS是通過光解作用釋放的。
• 空間阻礙:結(jié)合位點(diǎn)周圍的大基團(tuán)可能需要具有更長間隔臂的試劑。