ProteOrange 染料可以在聚丙烯酰胺凝膠中電泳后快速、輕松地可視化蛋白質(zhì)。 ProteOrange 是一種二苯乙烯型熒光團,含有兩性離子片段。在核酸、多糖和其他分子存在的情況下,蛋白質(zhì)/十二烷基硫酸鈉膠束 (SDS) 選擇性地結(jié)合染料。 ProteOrange 可有效對分子量為 6 kDa 及以上的蛋白質(zhì)進行染色。在三個數(shù)量級覆蓋的濃度范圍內(nèi),熒光信號與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系。
ProteOrange 凝膠染色的靈敏度大約是考馬斯染色的十倍,但不如銀染色敏感。對于 ProteOrange,檢測限為每條帶 3 ng 蛋白質(zhì)(考馬斯的檢測限約為 30 ng,銀染的檢測限約為 0.5 ng)。然而,與銀染相比,ProteOrange 染色的方案要簡單得多,因為它不需要洗滌,也不需要標準 SDS-PAGE 的固定。實驗流程需要 30-60 分鐘才能完成,包括在含有染料的 7.5% 乙酸水溶液中孵育凝膠,以及用 7.5% 乙酸短暫沖洗凝膠 30 秒。應使用波長為 312-365 nm 的透射儀進行可視化。 ProteOrange 庫存溶液在室溫下避光保存。
確保染料原液不含沉淀物。如果不是這種情況,請將試劑在 70 °C 下保持幾分鐘,直至沉淀物全溶解,然后搖動小瓶。
準備染料的工作溶液。準備的量取決于凝膠塊的大小和托盤尺寸。例如,25 mL 的溶液足以制備 10 × 15 cm 的凝膠片。要制備此溶液,請將 1.88 mL 冰醋酸溶解在 23 mL 水中,制成 7.5% 乙酸,并添加 5 μl 5000x ProteOrange 溶液。攪拌均勻,避光保存不超過三小時。
電泳結(jié)束后,將凝膠放入托盤中,加入染料工作液,避光孵育20-60分鐘(對于較薄的凝膠或較低百分比的凝膠,應縮短時間;對于1 mm的凝膠,60分鐘最佳厚,15% 凝膠)。染料的工作溶液只能使用一次,因為重復使用會導致靈敏度降低。
用 7.5% 乙酸溶液(不含染料)沖洗凝膠 30 秒。凝膠已準備好進行可視化。
為了可視化,將凝膠放在透照儀上。
要去除染料,請將凝膠在 0.1% Tween 20 溶液中孵育 10-12 小時,或用 7.5% 乙酸溶液反復清洗。
為了提高靈敏度,我們建議在 TGB 緩沖液中添加 0.05% SDS(相對于標準 0.1%)進行電泳。 SDS 濃度的這種變化不會影響蛋白質(zhì)的遷移率,但會縮短染色時間。
在含有甲醇/乙醇的溶液中染色之前不要固定凝膠。
對于小蛋白質(zhì)或低百分比凝膠,應選 10% 乙酸溶液。
該染料不適用于將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上后對其進行染色。
如果凝膠用于蛋白質(zhì)印跡,ProteOrange 染色可以在標準轉(zhuǎn)運緩沖液中進行,但這會導致靈敏度下降。
對于 Triton X-100 凝膠電泳,電泳完成后立即在 Triton X100 不含 TGB 緩沖液中清洗凝膠(3×20 分鐘),然后不久將凝膠在添加了 0.05% SDS 的 TGB 緩沖液中孵育 30 分鐘,然后進行染色。
為了在電泳過程中對蛋白質(zhì)進行染色,ProteOrange 應溶解在上層(陰極)緩沖液中。電泳結(jié)束后,將凝膠在 7.5% 乙酸溶液中孵育 30 分鐘,以降低熒光背景水平。
無需 SDS 即可對凝膠進行染色,但該方法的靈敏度會降低,并且靈敏度很大程度上取決于蛋白質(zhì)的氨基酸組成。除非電泳后應回收天然蛋白質(zhì),否則凝膠應在含有 0.05% SDS 的緩沖液中孵育,并根據(jù)標準方案進行染色。
通常,預染色的蛋白梯用 ProteOrange 進一步染色時不會發(fā)出熒光。僅使用未染色的梯子。
用 ProteOrange、考馬斯染色或銀染色后仍然可以進行。