該酪酰胺信號放大 (TSA) 方案可用于通過免疫染色或 原位雜交檢測過氧化物酶標記樣品中的信號。所有孵育均在搖床上進行。
2-4% 甲醛,pH 7.4
磷酸鹽緩沖液 (PBS),pH 7.4
PBT:0.1% Tween-20; PBS,pH 7.4
1 mM 疊氮*鈉的 PBT 溶液
30 % H2O2
1 mg/ml熒光標記酪酰胺,標記 級 DMSO
可選:
硫酸葡聚糖 (DS)
4-碘苯酚
酸性甘氨酸緩沖液:0.1 M 甘氨酸; pH 2.0; 0.1% 吐溫-20
按要求的方式固定樣品。通常,用冷的 2-4% 甲醛(pH 7.4)進行固定。用磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)和PBT (0.1% Tween-20;PBS,pH 7.4)清洗固定劑中的樣品。
通過將樣品在 抑制溶液(PBT 中的 1 mM 疊氮*鈉)中室溫孵育 30-60 分鐘來抑制內(nèi)源過氧化物酶活性。
可選??梢允褂?PBT 中的 3% H 2 O 2或 0.02 N HCl代替 1 mM 疊氮*鈉進行抑制。對于后續(xù)的免疫化學,該階段可以與阻斷抗體的非特異性結合相結合。為此,必須將封閉血清或 1% BSA 添加到疊氮化物或 H 2 O 2 溶液中。
筆記!如果背景較低且進行原位雜交,則可以跳過此步驟;直接進入步驟4。
在室溫下,在 PBT 中孵育 3 次,每次 10 分鐘,從抑制溶液中清洗樣品。
執(zhí)行所有免疫化學或 原位雜交步驟,用過氧化物酶偶聯(lián)抗體標記樣品。
室溫下在 PBT 中孵育 3 次,每次 10 分鐘,清洗樣品以去除抗體。
使用前立即制備反應緩沖液。為此,用 30% H 2 O 2將 PBT 稀釋兩次,每次 1:100,直至最終濃度為 0.003% (1:10000)。
可選。為了提高方法的靈敏度,可以將以下組分添加到反應混合物中(單獨或組合):
2% 硫酸葡聚糖 (DS) 用于增加反應混合物的粘度。
500 µg/ml 4-碘苯酚用于增強過氧化物酶反應。以 1:200 稀釋儲備液(100 mg/ml 乙醇溶液)使用更方便。
將 1 至 10 μg/ml標記的酪酰胺添加到反應緩沖液中(最佳濃度必須通過實驗確定)。通過搖動混合。
將樣品與反應緩沖液在黑暗中室溫孵育 5-30 分鐘(確切時間通過實驗確定;可以以 15 分鐘為起點)。
將樣品在抑制劑溶液(1 mM 疊氮*鈉的 PBT 溶液)中在室溫下避光孵育 10 分鐘來終止反應。
用 PBS 清洗樣品 3 次,每次 10 分鐘。
要重復抗體-TSA 標記周期,請在室溫下用酸性甘氨酸緩沖液(0.1% Tween-20;0.1 M 甘氨酸,pH 2.0)處理樣品 10 分鐘。該過程分離抗原結合的抗體,而不影響與蛋白質(zhì)共價結合的酪酰胺。
使用封固劑將樣品封固在蓋玻片下 。