反應(yīng)性HMR Hm Mk Pg
靈敏度內(nèi)源性
分子量(kDa)65
來源/同種型兔免疫球蛋白G
產(chǎn)品使用信息
應(yīng)用稀釋
蛋白質(zhì)印跡法1:1000
Simple Western™1:10 - 1:50
免疫沉淀1:50
免疫熒光(免疫細(xì)胞化學(xué))1:800 - 1:3200
流式細(xì)胞儀(固定/透化)1:800 - 1:3200
貯存 含有 10 mM HEPES 鈉 (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 疊氮化na。儲存于 –20°C。不要等分抗體。
蛋白質(zhì)印跡實驗方案 對于蛋白質(zhì)印跡,將膜與稀釋的一抗在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween ® 20 中一起在 4°C 下孵育過夜,并輕輕搖動。 注意:請參閱一抗產(chǎn)品網(wǎng)頁了解推薦的抗體稀釋度。
A. 溶液和試劑 從樣品制備到檢測,您的蛋白質(zhì)印跡所需的試劑現(xiàn)在都在一個方便的套件中:#12957蛋白質(zhì)印跡應(yīng)用解決方案套件 注:用反滲透去離子水 (RODI) 或同等級別的水制備溶液。
20X 磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS):( #9808 ) 要制備 1 L 1X PBS:將 50 ml 20X PBS 添加到 950 ml dH 2 O 中,混合。
10X Tris 緩沖鹽水 (TBS):( #12498 ) 要制備 1 L 1X TBS:將 100 ml 10X 添加到 900 ml dH 2 O 中,混合。
1X SDS 樣品緩沖液:藍(lán)色上樣包 ( #7722 ) 或紅色上樣包 ( #7723 ) 通過將 1/10 體積的 30X DTT 添加到 1 體積的 3X SDS 上樣緩沖液中來制備新鮮的 3X 還原性上樣緩沖液。用 dH 2 O稀釋至 1X。
10X Tris-Glycine SDS 電泳緩沖液:( #4050 ) 要制備 1 L 1X 電泳緩沖液:將 100 ml 10X 電泳緩沖液添加到 900 ml dH 2 O 中,混合。
10X Tris-甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液:( #12539 ) 要制備 1 L 1X 轉(zhuǎn)移緩沖液:將 100 ml 10X 轉(zhuǎn)移緩沖液添加到 200 ml 甲醇 + 700 ml dH 2 O 中,混合。
10X Tris 緩沖鹽水與 Tween ® 20 (TBST):( #9997 ) 要制備 1 L 1X TBST:將 100 ml 10X TBST 添加到 900 ml dH 2 O 中,混合。
脫脂奶粉:(#9999)。
封閉緩沖液:1X TBST,含 5% w/v 脫脂奶粉;對于 150 毫升,將 7.5 克脫脂奶粉添加到 150 毫升 1X TBST 中并充分混合。
洗滌緩沖液:( #9997 ) 1X TBST。
牛血清白蛋白 (BSA):( #9998 )。
一抗稀釋緩沖液:1X TBST,含 5% BSA;對于 20 ml,將 1.0 g BSA 添加到 20 ml 1X TBST 中并充分混合。
生物素化蛋白梯檢測包:( #7727 )。
藍(lán)色預(yù)染蛋白質(zhì)標(biāo)記物,寬范圍 (11-250 kDa):( #59329 )。
印跡膜和紙:( #12369 ) 該方案已針對硝酸纖維素膜進(jìn)行了優(yōu)化。通常建議孔徑為 0.2 µm。
與 HRP 綴合的二抗:抗兔 IgG、HRP 連接抗體 ( #7074 )。
檢測試劑:SignalFire™ ECL 試劑 ( #6883 )。
B. 蛋白質(zhì)印跡 樣品制備的通用方案。
通過添加含有調(diào)節(jié)劑的新鮮培養(yǎng)基來處理細(xì)胞所需的時間。
從文化中吸取介質(zhì);用 1X PBS 清洗細(xì)胞;吸出。
添加 1X SDS 樣品緩沖液(6 孔板每孔 100 µl,10 cm 直徑板每孔 500 µl)裂解細(xì)胞。立即從板上刮下細(xì)胞并將提取物轉(zhuǎn)移至微量離心管中。保持在冰上。
超聲處理 10–15 秒以完成細(xì)胞裂解并剪切 DNA(以降低樣品粘度)。
將 20 µl 樣品加熱至 95–100°C 5 分鐘;在冰上冷卻。
微量離心 5 分鐘。
將 20 µl 上樣到 SDS-PAGE 凝膠 (10 cm x 10 cm) 上。
注:建議加載預(yù)染色分子量標(biāo)記(#59329,10 µl/泳道)以驗證
電轉(zhuǎn)移和生物素化蛋白質(zhì)梯(#7727,10 µl/泳道)以確定分子量。
電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜 ( #12369 )。
C. 膜封閉和抗體孵育
注:體積適用于 10 cm x 10 cm (100 cm 2 ) 的膜;對于不同尺寸的膜,相應(yīng)地調(diào)整體積。
I. 膜封閉
(可選)轉(zhuǎn)膜后,用 25 ml TBS 室溫清洗硝酸纖維素膜 5 分鐘。
將膜在 25 ml 封閉緩沖液中室溫孵育 1 小時。
用 15 ml TBST 洗滌 3 次,每次 5 分鐘。
二.一抗孵育
將膜和一抗(按照產(chǎn)品網(wǎng)頁中推薦的適當(dāng)稀釋度和稀釋劑)在 10 ml 一抗稀釋緩沖液中孵育,并在 4°C 下輕輕攪拌過夜。
用 15 ml TBST 洗滌 3 次,每次 5 分鐘。
將膜與抗兔 IgG、HRP 連接抗體 ( #7074 at 1:2000) 和抗生物素、HRP 連接抗體 ( #7075 at 1:1000–1:3000) 一起孵育,以檢測 10 ml 溶液中的生物素化蛋白質(zhì)標(biāo)記物室溫下輕輕攪拌封閉緩沖液 1 小時。
用 15 ml TBST 洗滌 3 次,每次 5 分鐘。 繼續(xù)檢測(D 部分)。
D. 蛋白質(zhì)檢測
使用指南:
在 TBST 中洗滌膜結(jié)合的 HRP(抗體偶聯(lián)物) 3 次,每次 5 分鐘。
通過稀釋一份 2X 試劑 A 和一份 2X 試劑 B(例如,對于 10 ml,添加 5 ml 試劑 A 和 5 ml 試劑 B)來制備 1X SignalFire™ ECL 試劑 ( #6883 )。攪拌均勻。
將基質(zhì)與膜一起孵育 1 分鐘,除去多余的溶液(膜保持濕潤),用塑料包裹并暴露于 X 射線膠片。
* 避免反復(fù)接觸皮膚。