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蛋白質(zhì)如何與羧化金納米顆粒的共價結(jié)合

更新時間:2023-12-28      點擊次數(shù):596

金納米顆粒綴合物已廣泛應用于生物研究和生物傳感應用。例如,金納米顆??梢杂米鞴鈱W或電子顯微鏡、側(cè)流免疫測定和免疫印跡方案(例如斑點印跡和蛋白質(zhì)印跡)中的探針。 

制備金綴合物有兩種方法,即被動吸附和通過連接體的共價偶聯(lián)。盡管制備過程相對簡單,但蛋白質(zhì)對金納米顆粒的被動吸附并不能提供涂層的附著,因為隨著時間的推移,分子可能會從表面解吸。此外,在某些情況下,蛋白質(zhì)在吸附到表面后會失去其特性,這可能是由于三級結(jié)構(gòu)的變化或活性位點/抗原結(jié)合位點與金表面的結(jié)合使其難以接近而引起的。

盡管存在這些缺點,蛋白質(zhì)被動吸附到金納米顆粒上仍然很受歡迎,并且是生成蛋白質(zhì)金綴合物的簡單方法。通過被動吸附到標準球形金納米粒子來制備金納米粒子蛋白綴合物,可以使用我們方便的被動吸附金綴合優(yōu)化套件進行優(yōu)化。

與被動吸附相比,共價偶聯(lián)將感興趣的分子固定在功能化金納米顆粒上(例如帶有NHS、羧基或胺基團)。與被動吸附方法相比,這種方法大大提高了蛋白質(zhì)涂層的穩(wěn)定性。共價偶聯(lián)使用與待綴合分子上的特定化學基團反應的化學接頭。因此,該方法比被動吸附方法更具特異性和可控性,并且可以針對特定應用優(yōu)化共價綴合配體的數(shù)量。通過接頭的共價偶聯(lián)還具有最小化空間位阻和對綴合蛋白三級結(jié)構(gòu)的影響的優(yōu)點。總而言之,這對綴合蛋白的性質(zhì)產(chǎn)生的有害影響較小。 

我們的羧基金納米粒子、羧基金納米海膽和羧基金納米棒均依賴于 EDC/NHS 化學進行結(jié)合。 EDC 和 NHS“激活"顆粒表面的羧基,形成中間體,隨后與特定蛋白質(zhì)或其他待綴合配體上的伯胺基團反應。EDC 綴合的效率通常較低,并且對 pH 值和共價鍵敏感耦合協(xié)議需要一定程度的優(yōu)化才能實現(xiàn)所需的性能或穩(wěn)定性。 

以下方案提供了將生物分子與我們的羧化金納米顆粒偶聯(lián)的一般指南,以標準 IgG 與我們的 20 nm 羧基金納米顆粒的偶聯(lián)為例。對于其他生物分子或納米粒子類型的綴合,最佳綴合條件可能會有所不同。為了獲得與顆粒表面的最大結(jié)合,用于結(jié)合的蛋白質(zhì)的量比全覆蓋所需的理論量多大約1至10倍。 

所需材料和設備

  • 20nm羧基金納米粒子 

  • 甲基金納米粒子(陰性對照)

  • 1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC)(Sigma,目錄號 E1769)

  • N-羥基磺基琥珀酰亞胺 (Sulfo-NHS)(Sigma,目錄號 56485)

  • 陽性對照蛋白:辣根過氧化物酶 (HRP) 或來自人血清的 IgG(Sigma,目錄號 I4506)

  • 阻斷劑:牛血清白蛋白 (BSA)(Sigma,目錄號 A3059)

  • 激活緩沖液:2-(N-嗎啉代)乙磺酸 (MES) 緩沖液(10 mM,pH 5.5)

  • 偶聯(lián)緩沖液:1X 磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)

  • 洗滌緩沖液:1X 磷酸鹽緩沖鹽水 + 0.05% Tween 20 (PBST)

  • 紫外可見分光光度計

  • 待綴合的目標蛋白

注意:待綴合的蛋白質(zhì)必須是純凈的且不含污染蛋白質(zhì)(例如 BSA)和其他含胺成分。任何其他含有伯胺的分子都可能與待綴合的蛋白質(zhì)競爭,并可能導致綴合效率顯著降低。該蛋白質(zhì)還應該具有足夠的可接近的伯胺基團用于綴合。賴氨酸殘基是 EDC 綴合的主要靶位點。 

程序

  1. 如果金納米粒子的濃度低于OD 50,則通過離心濃縮它們。如果緩沖液中有顆粒,則通過離心在純水中清洗它們。有關(guān)說明,請參閱“金納米顆粒處理和儲存"。

  2. 在 MES 緩沖液中制備濃度分別為 30 和 36 mg/mL 的新鮮 EDC/NHS 混合溶液。請注意,EDC/NHS 在水溶液中會迅速水解,應在結(jié)合前新鮮制備。

  3. 取 10 µL 20 nm 金納米粒子(水中 OD 50)并與步驟 2 中制備的 10 µL EDC/NHS 混合溶液混合。

  4. 室溫孵育 30 分鐘

  5. 添加 1 mL PBST 并渦旋 

  6. 6,500 g 離心 30 分鐘

  7. 除去大部分上清液

  8. 添加 10 µL 抗體(1 X PBS 中 1 mg/mL)*

  9. 在水浴超聲儀中超聲 10 秒

  10. 室溫下攪拌孵育 2 至 4 小時

  11. 添加 1 mL PBST 并渦旋

  12. 6,500 g 離心 30 分鐘

  13. 除去大部分上清液

  14. 添加 50 µL PBS 和 1% BSA

  15. 儲存于 4 度即可使用

* 蛋白質(zhì)的濃度可能會根據(jù)顆粒大小和要結(jié)合的蛋白質(zhì)而變化。一般來說,蛋白質(zhì)的量應比全表面覆蓋的量多 1 至 10 倍。應估計顆粒的總表面積和對接面積,以計算最佳的蛋白質(zhì)含量。下表是將 IgG 與不同尺寸的羧基金顆粒結(jié)合的一般參考。其他蛋白質(zhì)的計算類似,但需要計算您感興趣的蛋白質(zhì)的對接面積。

表 I.  EDC 綴合期間不同尺寸的羧基金納米顆粒的 IgG 的建議量。 IgG 分子的對接面積估計為 45 nm2。 “NX全覆蓋量"是指孵育量與顆粒表面全覆蓋所需量之間的過量比。

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