蛋白質(zhì)印跡是一種常用的分子生物學(xué)技術(shù),用于分析樣品中感興趣的蛋白質(zhì)。細(xì)胞裂解物由細(xì)胞培養(yǎng)物裂解產(chǎn)生,并在凝膠電泳 (SDS-PAGE) 中按重量分離。然后這些蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上,在膜上它們被封閉并用特異性抗體探測(cè)以檢測(cè)感興趣的蛋白質(zhì)。借助靈敏且特異的抗體,可以輕松檢測(cè)小樣品中的修飾蛋白質(zhì)或未修飾蛋白質(zhì)。
協(xié)議:
1. 在封閉液(TBST 中的 5% 脫脂牛奶(50mM Tris、100mM NaCl、0.05% Tween-20,pH 7.6)中振蕩孵育 1 小時(shí),封閉膜。
注意:對(duì)于磷酸化特異性抗體,使用封閉液中的 5% BSA。
2. 在封閉液中以適當(dāng)?shù)南♂尪认♂屢豢埂?/span>
3. 將膜與稀釋的一抗在 40°C 下攪拌孵育過(guò)夜。
4. 去除抗體溶液。室溫下在 TBST(50mM Tris、100mM NaCl、0.05% Tween-20、pH 7.6)中搖動(dòng)洗滌膜 3 次,每次 5-10 分鐘。
注意:將 Tween-20 濃度增加至 0.1% 可降低背景并提高特異性,但會(huì)降低靈敏度。
5. 將膜與在封閉液中稀釋(根據(jù)制造商說(shuō)明)的二級(jí) AP 或 HRP 綴合物一起在室溫下振蕩孵育 1 小時(shí)。
6. 按照步驟 4 清洗膜。
7. 在進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)之前,用 TBS 清洗膜 2-5 分鐘。
8. 根據(jù)制造商的說(shuō)明制備和使用化學(xué)發(fā)光底物(用于 AP 或 HRP)。
9. 立即包裹膜并在 X 射線膠片下曝光 10 秒至 1 小時(shí)。暴露時(shí)間可能根據(jù)抗體和抗原的量而變化?;蛘叻湃氤上駜x中并進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。