一、包裝及稀釋：
Lumafuor 的珠子裝在密封小瓶中，并將濃縮的珠子懸浮在蒸餾水中。如果使用紅色微珠作為神經(jīng)通路的逆向示蹤，推薦稀釋方法：大鼠視覺皮層可采用1:4稀釋，且不會降低微珠熒光標記的強度和質(zhì)量。但對于第一次實驗，我們不建議使用稀釋的微珠，而是使用原液進行進樣示蹤。除蒸餾水外，也可使用常規(guī)鹽溶液如 NaCl 和 KCl 作為稀釋劑。如果使用綠色珠子，強烈建議使用原液而不需稀釋。
二、儲存：
為了避免蒸發(fā)，珠溶液應保存在4度冰箱中。不要冷凍它！冷凍的豆子將毫無用處，無法使用。干燥后的珠子也不能使用（不能重新懸?。?，產(chǎn)品沒有明顯的使用壽命。如果按要求保存，可保存數(shù)年。
三、注射：
珠子最好使用壓力注射，如1ml Hamilton 微量注射器或氣動注射系統(tǒng)。如需小面積顯微注射（30-50nl），可采用末端直徑為30-50um的玻璃電極進行注射，而較大直徑的玻璃電極可用于常規(guī)反向示蹤（注射量0.1-0.3ul）。然而，即使劑量較高，珠子也不會從注射部位顯著擴散（通常小于 1 毫米）。因此，為了盡可能完整地標記投射到更大核的神經(jīng)元，需要多點注射。盡管珠子帶負電，但不建議將離子滲透法用于示蹤珠子。
4、生存時間：
在大多數(shù)恒溫脊椎動物系統(tǒng)中，檢測珠子的最短有效時間是24小時。 48小時內(nèi)，標記強度隨進樣時間增加而增加，48小時后熒光強度保持恒定。對于冷血動物，建議檢測珠子的時間為 1 周。目前尚未檢測出珠子的最長可檢測周期。然而，珠子的熒光強度和質(zhì)量可以在體內(nèi)至少14個月保持不變，并且細胞可能被長時間標記。尚未發(fā)現(xiàn)珠子對動物或神經(jīng)元有毒性作用。
五、固定及處理：
標準固定方法是：0.1mpbs洗滌或灌注并固定在4%多聚甲醛中（0.1mpbs制劑，pH7.4）。用戊二醛固定會產(chǎn)生大量的組織自發(fā)熒光，這會阻礙珠子標記的神經(jīng)元。而且戊二醛固定的組織中不會全觀察到綠色珠子，因此應盡量避免。如果使用冷凍切片，則應使用 PBS 沖洗切片并用明膠包被的載玻片干燥。風干后，載玻片應用二甲苯放置 1 分鐘透明，然后用熒光封片或 krystalon 密封。 Fluoromount可以從atomrgic chemetals Corp. (Farmingdale, NY)購買；克里斯塔隆可以從
Harleco（EM Industries，新澤西州吉布斯敦）。切片只能短時間接觸乙醇或二甲苯，但長期接觸（超過 5 分鐘）會損壞珠子。微珠對甘油非常敏感，在甘油環(huán)境中熒光會很快被提取。因此，不宜使用甘油封孔劑。如果無法避免，可用水楊酸甲酯代替甘油作為封閉劑。如果將切片保存在黑暗環(huán)境中，熒光珠標記的細胞一年內(nèi)無法提?。ǖ衅臒晒獗尘皶黾樱?。到目前為止，還沒有珠子標記的組織涂有塑料材料的記錄。
觀察：
紅珠中的染料是羅丹明，所以所有與羅丹明配套的熒光濾光片都可以使用。尼康公司一些舊的羅丹明濾光片由于背景較高，可能無法觀察到熒光珠。一般情況下，蔡司、徠茲的標準羅丹明濾光片可以獲得較好的觀察效果。大多數(shù)綠色熒光濾光片都可以很好地觀察綠豆的熒光結(jié)果。設置為熒光黃的濾光片可以獲得強烈明亮的熒光，但也帶來較高的背景干擾。結(jié)果表明，較寬波段的熒光濾光片比窄帶濾光片可以獲得更強的熒光信號。經(jīng)過長時間的觀察和拍照，珠子的熒光沒有出現(xiàn)。
掃一掃，關注微信
當前位置：