流式細(xì)胞分析方案主要分為4個(gè)步驟:
樣品制備:應(yīng)通過(guò)機(jī)械分離方法或化學(xué)解離技術(shù)制備單細(xì)胞懸液,如采用酶溶液或鈣螯合試劑。
封閉:通常采用抗Fc抗體稀釋液懸浮細(xì)胞,防止一抗非特異性結(jié)合。
抗體孵育:流式細(xì)胞分析的孵育步驟涉及多種組分,包括一抗、二抗、鏈霉親和素和熒光染料。
數(shù)據(jù)采集:大多數(shù)流式細(xì)胞儀都配備獲取和轉(zhuǎn)化細(xì)胞特征信號(hào)必需的軟件。用戶可根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)要求設(shè)定具體的軟件參數(shù)。
除了目標(biāo)細(xì)胞之外,每次進(jìn)行流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還應(yīng)包含以下對(duì)照:
至少一份未染色樣品,與試樣同時(shí)進(jìn)行每一步的緩沖液孵育,以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的流速和電壓。
一份適當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照樣品,與試樣基本相同,但用在一抗的宿主種屬中生產(chǎn)的同型對(duì)照替代試樣中的一抗。該對(duì)照用于非特異性結(jié)合二抗。
如有需要也可準(zhǔn)備一份已知表達(dá)所有目標(biāo)抗原的細(xì)胞組成的陽(yáng)性對(duì)照,并與試樣共同孵育,但僅用單色檢測(cè)。
同其他免疫檢測(cè)應(yīng)用一樣,流式細(xì)胞分析也可通過(guò)多種方法利用抗體探測(cè)特定的細(xì)胞基元。兩大常用方法為:直接檢測(cè)法和間接檢測(cè)法。
直接檢測(cè)法是一種一步染色工藝,通過(guò)一抗特異性結(jié)合目標(biāo)抗原,可直接結(jié)合支持成像或其他結(jié)合狀態(tài)檢測(cè)的分子。探測(cè)位于細(xì)胞表面的抗原時(shí),不建議固定細(xì)胞,否則可能導(dǎo)致抗體探針無(wú)法接觸目標(biāo)抗原。因此,在數(shù)據(jù)采集結(jié)束前保持細(xì)胞活力十分重要。如要查找直接檢測(cè)法的抗體,可采用Antibody Explorer抗體搜索工具,將Search Within(搜索范圍)設(shè)為“Primary Antibodies Only"(僅限一抗),application(應(yīng)用)選擇“flow cytometry"(流式細(xì)胞分析)。
間接檢測(cè)法先用純化抗體與目標(biāo)抗原孵育結(jié)合,再用熒光染料標(biāo)記的二抗(特異性靶向一抗宿主同型)與一抗特異性結(jié)合,形成一抗-熒光二抗復(fù)合物。采用純化一抗搭配各種波長(zhǎng)(或顏色)的熒光染料標(biāo)記二抗(特異性針對(duì)生產(chǎn)一抗的宿主同型)可提升抗體庫(kù)的模塊化程度。