使用 RNAstorm™ 試劑盒獲得的 RNA 中是否存在任何污染的基因組 DNA？

基因組 DNA 的污染是一個大問題，因為它會干擾下游應(yīng)用。 RNAstorm™ 試劑盒包括優(yōu)化的 DNase 消化步驟，可去除污染的基因組 DNA，而不顯著影響 RNA 產(chǎn)量。雖然此步驟是可選的，但強烈建議這樣做。

我期望從 FFPE 樣品中獲得多少 RNA？

影響獲得的RNA總量的最大變量是樣品本身的質(zhì)量（即組織的類型和數(shù)量，以及樣品分離和保存的注意事項）。使用 RNAstorm™ 試劑盒，并假設(shè)至少合理的樣品質(zhì)量，可以獲得大于 1 µg 的量。

使用RNAstorm™試劑盒獲得的RNA可以用于RNA-Seq嗎？

是的。只要 RNA 的質(zhì)量足夠高，就可以獲得高質(zhì)量的文庫。對于 Illumina 測序，建議 DV200 至少為 30%，并且應(yīng)使用提供至少 1 µg RNA 的樣品。

組織應(yīng)該如何準(zhǔn)備？

使用切片機從 FFPE 樣品中獲取 5-10 µm 的切片。如果可以可靠地切割，可以使用小于 5 µm 的切片。不建議使用厚度超過 10 µm 的切片，因為它們可能無法全消化。此外，每次提取應(yīng)使用不超過 5 個切片（每個 10 µM）。使用過多的組織會導(dǎo)致消化不全并降低產(chǎn)量。

我可以使用非石蠟包埋的組織嗎？

是的，可以使用未包埋在石蠟中的組織。在這種情況下，我們建議機械研磨相當(dāng)于推薦切片數(shù)量的組織。

我可以使用 FFPE 芯嗎？

是的，可以使用 FFPE 芯材。由于核心不使用切片機進(jìn)行處理，因此樣品消化往往更加困難，如果觀察到消化不全，建議使用機械均質(zhì)化（例如使用鋼珠）。

您推薦哪種脫蠟方法？

RNAstorm™ 試劑盒包含推薦的脫蠟試劑。與其他常見方法（例如二甲苯）不同，脫蠟試劑高效、無毒，并且不需要使用通風(fēng)柜。在我們的測試中，所包含的試劑在去除石蠟和純化高質(zhì)量核酸方面至少與二甲苯一樣有效。

定量從 FFPE 樣品中獲得的 RNA 的最佳方法是什么？

與從新鮮樣品中獲得的 RNA 相比，準(zhǔn)確定量 FFPE 衍生的 RNA 更具挑戰(zhàn)性。僅僅知道存在的 RNA 的絕對量是不夠的，還要知道 RNA 是否會在下游應(yīng)用中發(fā)揮作用，這取決于以下因素：

• 片段大小分布：如果 5 µg 樣品（通過 Qubit 測量）包含 < 200 nt 的片段，則它對于 RNA-Seq 可能毫無用處。

• 化學(xué)修飾：對于從福爾馬林固定的樣品中獲得的RNA，各種化學(xué)加合物和交聯(lián)，包括堿基修飾、堿基-堿基交聯(lián)和堿基-蛋白質(zhì)交聯(lián)，可以使核酸分子無法被酶接觸，從而在下游應(yīng)用中失活。

• 污染：純化過程中使用的細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、鹽和洗滌劑可能會導(dǎo)致下游檢測產(chǎn)生偏差。例如，Nanodrop 等基于 UV/Vis 的方法特別容易受到 200-280 nm 范圍內(nèi)吸收的污染物的影響。

• 基于熒光的方法（例如 Qubit）容易出現(xiàn)重大錯誤。當(dāng)使用低濃度的 DNA 或 RNA 時，基于染料的檢測可能不是線性的。還必須注意 RNA 樣品中基因組 DNA 的污染，因為用于熒光定量的染料并不全針對 FFPE 衍生的 DNA 或 RNA。

• 定量 PCR 是定量嚴(yán)重受損和修飾核酸的方法。

是否應(yīng)該使用 RIN 編號來確定 FFPE 衍生 RNA 的質(zhì)量？

盡管 RIN 數(shù)可以提供有關(guān)樣品碎片程度的一般信息，但它不夠靈敏或可預(yù)測，不足以成為下游性能的有用指標(biāo)，尤其是對于 RNA-Seq。通常，F(xiàn)FPE 衍生 RNA 的 RIN 編號在 2 到 3 之間。其中一些樣本對 RNA-Seq 有用，而另一些則不會——但是，RIN 不會告訴您。

使用 Illumina 測序的 RNA-Seq性能預(yù)測指標(biāo)稍好一些的是 DV200，它代表長度超過 200 個核苷酸的 RNA 片段的百分比。 DV200 也是基于生物分析儀數(shù)據(jù)計算的，但與所有基于生物分析儀的方法具有相同的缺點，特別是高變異性。

從 FFPE 樣品中提取 RNA 時我需要了解什么？

• 避免基于有機溶劑 (Trizol) 的方法

• 避免刺激性離液鹽（即胍鹽）

• 避免使用影響 UV 和/或 Qubit 下游定量的清潔劑（例如 Triton X-100）

• 請勿依賴 RIN 來定量 FFPE 衍生樣品的完整性。看看為什么。請改用 DV200。

• 使用去除福爾馬林化學(xué)修飾的試劑盒或方法。請勿將溫度升至 80°C 或以上。即使在此溫度下停留很短的時間也會顯著降低完整性。

• 請警惕 Qubit 和 Nanodrop 濃度，因為可能會受到有機分子或 DNA 污染。

• 使用 qPCR 定量 RNA，并始終仔細(xì)觀察熔解曲線以確定是否發(fā)生非特異性擴增。