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鮑曼不動桿菌基因組DNA簡述

更新時間:2023-09-14      點擊次數(shù):472

鮑曼不動桿菌基因組DNA基本信息

培養(yǎng)基

蛋白胨:10.0,牛肉粉:3.0,氯化鈉:5.0,瓊脂:15.0,pH值:7.3±0.1(25℃)

傳代方法

使用前請先在緩沖液GD和漂洗液PW中加入無水乙醇,加入體積請參照瓶上的標(biāo)簽; 1.取細(xì)菌培養(yǎng)液1-5ml,10,000rpm(11,500×g)離心1min,盡量吸凈上清; 2.向菌體沉淀中加入200μL緩沖液GA,振蕩至菌體徹di懸浮。注意:對于較難破壁的革蘭氏陽性菌,可略過第2步驟,加入溶菌酶溶液進行破壁處理,具體方法為:加入110μL緩沖液(20mM Tris,pH8.0;2mM Na2-EDTA;1.2%Triton),和70μL溶菌酶溶液(50mg/mL,客戶自備,目錄號:RT401),37℃處理30min以上。如果需要去除RNA,可加入4μL RNase A(100mg/mL)溶液(客戶自備,目錄號:RT405-12),振蕩15sec,室溫放置5min; 3.向管中加入20μL Proteinase K溶液,混勻; 4.加入220μL緩沖液GB,振蕩15sec,70℃放置10min,溶液應(yīng)變清亮,簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。注意:加入緩沖液GB時可能會產(chǎn)生白色沉淀,一般70℃放置時會消失,不會影響后續(xù)實驗。如溶液未變清亮,說明細(xì)胞裂解不徹di,可能導(dǎo)致提取DNA量少和提取出的DNA不純; 5.加220μL無水乙醇,充分振蕩混勻15sec,此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀,簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠; 6.將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中),12,000rpm(13,400×g)離心30sec,倒掉廢液,將吸附柱CB3放入收集管中; 7.向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇),12,000rpm(13,400×g)離心30sec,倒掉廢液,將吸附柱CB3放入收集管中; 8.向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇),12,000rpm(13,400×g)離心30sec,倒掉廢液,吸附柱CB3放入收集管中; 9.重復(fù)操作步驟8; 10.將吸附柱CB3放回收集管中,12,000rpm(13,400×g)離心2min,倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘,以徹di晾干吸附材料中殘余的漂洗液。注意:這一步的目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除,漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)(酶切、PCR等)實驗; 11.將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中,向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μL洗脫緩沖液TE,室溫放置2-5min,12,000rpm(13,400×g)離心2min,將溶液收集到離心管中。注意:洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μL,體積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用ddH2O做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi),pH值低于7.0會降低洗脫效率;且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃,以防DNA降解。為增加基因組DNA的得率,可將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中,室溫放置2min,12,000rpm(13,400×g)離心2min;

生長條件

37℃;18-24h;好氧;

存儲條件

2-8℃



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