細(xì)胞增殖測定廣泛應(yīng)用于細(xì)胞毒性研究、癌癥研究和細(xì)胞生物學(xué)的許多其他領(lǐng)域。其中許多可以通過熒光標(biāo)記對增殖細(xì)胞進(jìn)行可視化,并且適合高通量篩選。
檢測復(fù)制的 DNA 可以說是檢測增殖的最直接方法。這是通過使用溴脫氧尿苷 (BrdU)核苷實(shí)現(xiàn)的,該核苷在復(fù)制過程中融入 DNA。然后,細(xì)胞 DNA 中的這些核苷修飾可以通過抗 BrdU 抗體檢測到。盡管具有特異性,但這種測定方法繁瑣且難以重現(xiàn),因?yàn)樾枰么碳ば栽噭┨幚砑?xì)胞,以使 DNA 暴露于抗體,否則這些抗體不會穿透細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
一種更溫和的替代方案是乙炔基脫氧尿苷 (EdU),可以通過將其添加到培養(yǎng)基中或注射到動物體內(nèi)來將其遞送至細(xì)胞。摻入 DNA 后,該核苷可在銅 (I) 催化下與各種熒光染料疊氮化物結(jié)合,從而對復(fù)制的 DNA 進(jìn)行熒光染色。該測定易于執(zhí)行、快速且可重復(fù)。它不需要對細(xì)胞進(jìn)行嚴(yán)酷的處理(只需要用 Triton 進(jìn)行透化),因此可以更好地保存細(xì)胞結(jié)構(gòu)。在用疊氮化染料處理和最后的洗滌步驟(步驟 8)后,可以使用具有各種發(fā)射波長的熒光團(tuán)(例如 Hoechst、DAPI 或熒光標(biāo)記抗體)來標(biāo)記細(xì)胞。
5-乙炔基-2'-脫氧尿苷 (EdU)
Cu-TBTA 絡(luò)合物— сlick сhemistry 催化劑
抗壞血酸— 銅的還原劑
疊氮化物熒光染料
DMSO,標(biāo)簽級— 疊氮化物溶劑
Triton X-100(或 Tween-20)
PBS,pH 7.4
100 mM Tris 緩沖液,pH 7.4
確切的方案取決于特定的細(xì)胞或組織類型,但一般工作流程如下所述:
將細(xì)胞/組織與 10–20 μM EdU 孵育所需的時(shí)間。
用含 3.7% 甲醛的 PBS 固定細(xì)胞 15 分鐘。
用 PBS 清洗細(xì)胞。
用含有 0.2% Triton X-100(或 0.5% Tween-20)的 PBS 透化細(xì)胞 30 分鐘。
再次用 PBS 清洗細(xì)胞。
在 100 mM Tris 緩沖液,pH 7.4(對于磺化疊氮化物)或 100 mM Tris 緩沖液,pH 7.4,含有 50% DMSO(對于非-磺化疊氮化物)。該混合物應(yīng)新鮮制備,因?yàn)殂~ (I) 在水溶液中不穩(wěn)定。
將細(xì)胞與點(diǎn)擊反應(yīng)混合物一起孵育 30 分鐘。
用 PBS 清洗細(xì)胞。
(可選)如果細(xì)胞必須用不同的熒光團(tuán)標(biāo)記,請使用標(biāo)準(zhǔn)方案繼續(xù)染色。
磺化(水溶性)疊氮化物,例如磺基氰疊氮化物和 AF 疊氮化物,可產(chǎn)生最佳效果。當(dāng)使用非磺化疊氮化物(例如氰疊氮化物或 BDP 疊氮化物)時(shí),確保反應(yīng)混合物中 DMSO 濃度為 50%。