1、為什么MACS磁珠分選要使用分選柱?
• 磁珠可以更小:美天旎磁珠直徑只有50nm,普通真核細(xì)胞直徑一般大于10um,結(jié)合在細(xì)胞上的磁珠大小可以忽略不計(jì),因此:1、攜帶的磁珠不影響細(xì)胞大小——可以直接上流式檢測,不影響FSC數(shù)據(jù)收集;2、細(xì)胞功能不受影響——分選過程中,磁珠的結(jié)合不會引起細(xì)胞的活化及其它生理狀態(tài)的改變,可以保持細(xì)胞的原始生理和功能狀態(tài),尤其在Naive免疫細(xì)胞的分選中尤為重要。
• 抗原表位的占據(jù)更少:因?yàn)榇艌隹梢员环诌x柱放大1000-10000倍,所以不需要太多的磁珠結(jié)合即可分離不同細(xì)胞。約20%-30%的抗原表位被偶聯(lián)了磁珠的抗體結(jié)合即可將細(xì)胞滯留在磁場中,這就為后續(xù)實(shí)驗(yàn)預(yù)留了足夠的抗原表位,因此,對于表達(dá)水平不低的抗原來說,MACS磁珠分選后的細(xì)胞可以直接進(jìn)行相關(guān)熒光抗體標(biāo)記,進(jìn)而進(jìn)行流式檢測。
• 細(xì)胞活力更好:通過分選柱引起的間接磁場放大,使得細(xì)胞在磁場中所承受的直接壓力小,讓細(xì)胞受力均勻;同時(shí),通過分選柱放大的磁場可以瞬時(shí)變大、離開磁場后磁力又瞬間消失,這些都保證了細(xì)胞所受機(jī)械力小,損傷小,得到的細(xì)胞活力高。
• 細(xì)胞純度更高:通過去除分選柱,可以更好的進(jìn)行去除分選,提高目的細(xì)胞的純度。
2、是不是所有細(xì)胞都要從分選柱上重新獲???
不是。
若使用陽性分選策略,目的細(xì)胞是磁性標(biāo)記的,在分選器和分選柱產(chǎn)生的磁場中滯留后,當(dāng)分選柱移出分選器,磁場瞬間消失,此時(shí)用活塞用力將分選柱中滯留的細(xì)胞推出,從而收集到目的細(xì)胞;
反之,若使用去除分選策略,此時(shí)目的細(xì)胞是非磁性標(biāo)記的,可直接從洗脫液中獲得。
3、MACS分選柱有哪幾種,如何選擇合適的分選柱?
MACS分選柱根據(jù)其細(xì)胞容量、用途可以分為幾種:
MS、LS、LD、大細(xì)胞分選柱、全血分選柱、autoMACS分選柱以及用于生物大分子分離的u柱等,選擇分選柱時(shí)要根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)策略和注重的實(shí)驗(yàn)效果來取舍,我們在之前的一期微信“如何選擇恰當(dāng)?shù)姆诌x柱"中有詳細(xì)的說明。
4、MACS分選柱能否重復(fù)使用?
普通的MACS分選柱不建議重復(fù)使用,但autoMACS分選柱分可以重復(fù)使用。
重復(fù)使用不能保證無菌,MACS分選柱都是獨(dú)立、無菌包裝的,保證分選下來的細(xì)胞無污染;
分選柱內(nèi)填充了經(jīng)親水包被層處理的鐵珠,如果通過浸泡、洗滌等過程重復(fù)使用,那么,鐵珠表面得親水層被破壞,裸露的鐵珠與細(xì)胞接觸會對流經(jīng)的細(xì)胞產(chǎn)生損失,影響細(xì)胞活力和分選效果。
5、那為什么autoMACS分選柱可以重復(fù)使用呢?
autoMACS分選柱可以在兩周之內(nèi)使用,且最多用100次。
autoMACS分選柱一旦安裝到全自動(dòng)分選儀上,須保存在液體中,防止分選柱中的填充基質(zhì)被氧化無法使用。
每次使用后應(yīng)該按照推薦程序進(jìn)行沖洗和消毒,以便更好的保存和下一次使用。
6、全血分選柱與普通分選柱有何不同?
全血分選柱有兩層特殊的基質(zhì),非磁性層和磁性層;普通細(xì)胞分選柱中填充的是均一的親水包被層處理的鐵珠;
全血分選柱柱容量為15ml的全血;
全血分選柱可用于直接從全血中分選細(xì)胞,無需進(jìn)行紅細(xì)胞裂解或者密度梯度離心的過程,無需先制備PBMC。