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Nanogold® 偶聯(lián)物分離方法

更新時間:2023-05-18      點擊次數(shù):408

將凝膠過濾作為分離 Nanogold® 結合物的方法:這是我們實驗室的常規(guī)使用方法,并且該方法已得到很好的表征。 Nanogold® 的分子量接近 15,000,但由于其中很大一部分是由非常致密的金原子組成的,因此在許多基于大小的分離技術(例如凝膠過濾)中,Nanogold 的表現(xiàn)就好像其 MW 更接近大約 8,000。

在計劃您的標記反應時,您應該使用過量的成分,根據(jù)尺寸更容易與 Nanogold® 標記的產(chǎn)品分離。如果您的分子小于 Nanogold®,您應該使用過量的較小分子進行標記反應(對于稍小的分子,大約 5 倍過量是一個很好的起點,對于小得多的分子,10 倍到 20 倍是一個很好的起點分子),因為從反應混合物中分離過量的小分子比分離過量的大分子更容易。

如果您要標記大于約 10,000 MW 的分子,您應該使用過量的 Nanogold®,因為現(xiàn)在它比過量的未反應生物分子更容易與偶聯(lián)物分離。對于大多數(shù)反應,兩倍到五倍的過量是合適的。

凝膠過濾介質及其分離特性的列表在我們的 偶聯(lián)物分離指南.

已經(jīng)嘗試了其他色譜方法,但迄今為止尚未給出可重現(xiàn)的結果。一種對十金有一定成功的方法是疏水相互作用色譜法,這種方法對十®金來說似乎很有希望。該方法的優(yōu)點是可用于從納米金偶聯(lián)物中分離較大和較小的雜質;pocedure基于Hainfeld描述的undecagold,undecagold-Fab'共軛物和unlabelfab'的分離:

應該注意的是,使用的技術是疏水作用色譜,而不是反相;該方法依賴于離子強度遞減的梯度,其中不同的固定化分子以不同的離子強度脫落。對于十一金和納米金實驗,都使用了丁基衍生化凝膠;還嘗試了聯(lián)苯衍生化凝膠,但丁基凝膠給出的結果最好。

使用三到六柱體積的梯度進行分離。將偶聯(lián)物溶解在2.0 M硫酸銨中,使用乙酸三乙基銨(5 mM)將pH調節(jié)至中性值(7或7.5)。用于梯度的兩個緩沖區(qū)是: (A)2M硫酸銨,使用三乙基乙酸銨(5mM)將pH調節(jié)至中性值(6.5,7或7.5)。 (B) 5 mM 三乙基乙酸銨,pH 7 或 7.5。 樣品進樣后,運行一體積的緩沖液A,然后在梯度上,緩沖液B的比例從0穩(wěn)定增加到100%,然后用緩沖液B繼續(xù)洗脫.使用該梯度,首先洗脫未偶聯(lián)的Fab',然后洗脫Nanogold-Fab',然后是未連接的Nanogold。

我們不推薦將凝膠電泳作為純化方法,因為 Nanogold® 顆粒在凝膠中的遷移是不可預測的,并且結合物的鑒定并不簡單。透析的結果好壞參半;然而,應謹慎行事,因為某些膜含有可降解 Nanogold® 的成分。

 


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