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聚乙二醇交聯(lián)多臂聚(L-賴氨酸)詳細(xì)介紹

更新時(shí)間:2023-04-12      點(diǎn)擊次數(shù):1525

介紹
在過去的幾十年中,納米技術(shù)已經(jīng)很好地發(fā)展到構(gòu)建藥物遞送系統(tǒng),包括但不限于膠束、脂質(zhì)體和納米顆粒[1-10]。與傳統(tǒng)制劑相比,這些納米級(jí)給藥系統(tǒng)(DDS)在提高藥物穩(wěn)定性、防止藥物過早釋放、改變藥物分布和延長(zhǎng)藥物半衰期方面表現(xiàn)出巨大潛力[11]。因此,它們被廣泛用于各種藥物的輸送,包括抗癌藥物[1,2],抗菌劑[3,4]和抗炎藥[5,6]等。


納米級(jí)DDS雖然在單藥治療藥物方面表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì),但在提高多病因疾病綜合療效方面仍存在諸多局限性。事實(shí)上,許多常見的臨床疾病是由多種因素相互作用引起的或惡化的。例如,燒傷創(chuàng)面感染常因細(xì)菌感染而加重,例如銅綠假單胞菌(銅綠假單胞菌)和金黃色葡萄球菌(金黃色葡萄球菌)[12]。當(dāng)肝實(shí)質(zhì)和代謝功能的大量喪失誘發(fā)急性肝衰竭時(shí),患者將變得易感病原體,這在很大程度上限制了晚期緊急肝移植的可行性[13]。另據(jù)報(bào)道,細(xì)菌感染可能是誘導(dǎo)腫瘤形成的主要原因之一, 因此,應(yīng)同時(shí)采用抗癌和抗菌措施治療這些疾病,例如幽門螺桿菌誘發(fā)的胃癌[14]。因此,為了治療多因素疾病,應(yīng)合理開發(fā)DDS,以共同遞送治療劑和抗菌劑,如抗生素[3]、抗菌肽[15,16]、金屬離子[4]和天然化合物[17]。


為此,最常見的策略之一是在一個(gè)制劑中共同遞送兩種或兩種以上的藥物[18,19]。然而,由于納米載體的載藥空間有限,共遞送策略通常無法同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種藥物的充分載樣[18-20]。最近,聚(異賴氨酸)(PLL)基聚合物已被制造用于封裝帶負(fù)電荷的藥物,例如小分子藥物[21-23],蛋白質(zhì)[24,25]和核酸[26,27]。值得注意的是,Qiao等人[15]發(fā)現(xiàn)基于PLL的聚合物具有類似于普通抗菌肽(AMP)的殺菌機(jī)制,具有去除細(xì)菌感染的巨大潛力。我們之前的研究[16]還表明,多臂PLL(MPLL)具有高抗菌活性、巨大的選擇性和顯著的蛋白水解穩(wěn)定性, 代表了一系列治療耐藥感染的強(qiáng)效抗菌肽[16]。所有這些研究進(jìn)展都預(yù)測(cè),基于PLL的聚合物不僅可以作為藥物載體,還可以作為具有治療活性的大分子來協(xié)同治療效果,這意味著納米醫(yī)學(xué)針對(duì)多因素疾病的設(shè)計(jì)有了新的視角。


在這項(xiàng)研究中,設(shè)計(jì)、合成和評(píng)估了MPLL-alt-PEG(方案1)形式的聚乙二醇(PEG)交聯(lián)交替共聚物,作為陰離子藥物遞送和抗菌的平臺(tái)。具有支化聚乙烯亞胺(PEI)核心和聚(i-賴氨酸)外圍鏈的MPLL構(gòu)成了MPLL-alt-PEG共聚物的聚電解質(zhì)段。它們的多臂分子結(jié)構(gòu)具有較高的陽離子電荷密度,有利于通過靜電相互作用增強(qiáng)對(duì)陰離子藥物和細(xì)菌脂質(zhì)雙層的結(jié)合親和力[16]。預(yù)計(jì)MPLL-alt-PEG可以包封陰離子藥物,然后自組裝成殼交聯(lián)聚離子復(fù)合物(PIC)膠束(方案1)。 我們之前的研究表明,殼交聯(lián)膠束可能具有優(yōu)勢(shì),無效載藥,提高膠束穩(wěn)定性,并保護(hù)藥物免于過早釋放和降解[28]。同時(shí),交聯(lián)后MPLL的抗菌活性也可以提高,因?yàn)榻宦?lián)反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致分子量、蛋白水解穩(wěn)定性和體內(nèi)半衰期增加[16,29]。載藥MPLL-alt-PEG膠束可以整合負(fù)載藥物的治療效果和載體的抗菌活性。我們證明了MPLL-alt-PEG作為小分子藥物和治療性生物大分子的DDS的可行性,使用水溶性甲基橙(MO)和免疫激素重組人干擾素-a-2b(IFN)作為陰離子模型藥物。隨后 以革蘭陽性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和革蘭陰性銅綠假單胞菌為模型菌,研究了MPLL-alt-PEG的抗菌活性和機(jī)制。我們預(yù)計(jì)基于MPLL-alt-PEG的納米平臺(tái)可以作為治療細(xì)菌感染涉及多因素疾病的潛在系統(tǒng)。


2.材料與方法
2.1.材料
支化PEI(Mw = 0.8 kDa)是從Sigma-Aldrich(中國(guó)上海)獲得的。g-芐氧羰基-L-賴氨酸(ZLL)購自GL Biochem(中國(guó)上海),無需進(jìn)一步純化即可使用。PEG(琥珀酰亞胺羧甲酯)2(SCM-PEG-SCM,Mw = 7.5 kDa)由JenKem科技有限公司(中國(guó)北京)提供。甲基橙、苯甲醚、甲磺酸、和異硫氰酸熒光素(FITC)均來自阿拉丁(中國(guó)上海)。Viskase(美國(guó)伊利諾伊州達(dá)連)生產(chǎn)了分子量截止值(MWCO)為7和14 kDa的透析管,而50 kDa和100 kDa的透析管則從Spectrum Laboratories Inc.(美國(guó)加利福尼亞州洛杉磯)購買。IFN(500萬U)是從安徽安科生物科技有限公司(中國(guó)安徽)獲得的。
2.2.MPLL-alt-PEG共聚物的合成與表征
在PEI引發(fā)的e-芐氧羰基-L-賴氨酸N-羧酸酐(ZLL-NCA)聚合的連續(xù)過程中合成MPLL-alt-PEG共聚物,以制備PEI接枝聚(e-芐氧羰基-L-賴氨酸)(PEZ),然后與雙官能團(tuán)SCM-PEG-SCM進(jìn)行外圍交聯(lián),隨后去除芐氧羰基側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)(圖1)。
第一步,根據(jù)我們之前的報(bào)告,ZLL在無水乙酸乙酯中光氣化(收率:78%)制備ZLL-NCA,然后以PEI為大分子引發(fā)劑聚合d,得到星嵌段共聚物PEZ(產(chǎn)率:92%)[16,24,28,30]。


然后,將100mgPEZ溶解在50mLDMSO和250mL二氯甲烷(DCM)的混合物中。將DCM中濃度為0.2g-mL-1的SCM-PEG-SCM溶液滴加到PEZ溶液中,在25°C劇烈攪拌條件下滴加24小時(shí),產(chǎn)生PEZ-alt-PEG[28]。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮溶液以除去DCM,并透析(MWCO 14 kDa)對(duì)水。隨后,通過凍干得到PEZ-alt-PEG共聚物。產(chǎn)率:95%。


最后,將PEZ-alt-PEG溶于TFA中,然后加入苯甲醚和甲磺酸,室溫?cái)嚢?.5h后,用蒸餾水稀釋溶液,洗滌3次。收集水層,然后用碳酸氫鈉中和。之后,將樣品轉(zhuǎn)移到透析管(MWCO 7 kDa)中,并在5.0wt%NaHCOg水溶液下透析兩天,隨后在蒸餾水中透析五天。然后將透析產(chǎn)物凍干以獲得最終產(chǎn)物MPLL-alf-PEG。產(chǎn)量: 91 %
以DMSO-M為溶劑,在布魯克DMX 400 MHz波譜儀(德國(guó)卡爾斯魯厄布魯克)上端接P EZ和PEZ-alt-PEG的核磁共振(NMR)波譜,而MPLL-alt-PEG以D2 O為溶劑。各種cop聚合物的分子量通過配備沃特世51 5 HPLC泵和沃特世2414折光率檢測(cè)器的凝膠滲透色譜(GPC)系統(tǒng)(美國(guó)米爾福德沃特斯)測(cè)定。為了表征PEZ和PEZ-alt-PEG,使用線性聚甲基丙烯酸甲酯(PMMAs)作為標(biāo)準(zhǔn)品,以二甲基甲酰胺(DMF)為洗脫液分析樣品。為了表征MPLL-alt-PEG,對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)量,并使用0.50 M H Ac-N和Ac緩沖液(pH 4.5)作為淋洗液,線性PEG作為st標(biāo)準(zhǔn)品。


2.3.載藥MPLL-alt-PEG膠束的制備與表征
為了評(píng)估MPLL-alt-PEG對(duì)小陰離子分子的封裝,將給定量的MO加入到水中的MPLL-alt-PEG溶液中(10mL)中并攪拌5分鐘。然后將獲得的溶液在下沉條件下對(duì)水透析(MWCO 50 kDa)以除去游離客體分子。在相同條件下,選擇具有等量游離MO的溶液作為透析對(duì)照。當(dāng)對(duì)照組MO溶液透析至無色時(shí),得到MO/MPLL-alt-PEG膠束,用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定透析液中MO的含量。采用標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線定量0.1-6 mg-L-1濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)(r2)>0.99的MO,載藥量以MO對(duì)聚合物的質(zhì)量百分比計(jì)算。


為了評(píng)估MPLL-alt-PEG對(duì)陰離子生物大分子的包封,按照?qǐng)?bào)道的方法用FITC標(biāo)記IFN[31]。隨后,將MPLL-alt-PEG和FITC標(biāo)記的IFN(FITC-IFN)溶液分別溶解在濃度為2mg-mL-1的0.01M磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中。然后將1 mL IFN溶液滴加到5 mL聚合物溶液中,在超聲儀上超聲處理5 min(KQ-200 KDE,昆山超聲儀器有限公司
中國(guó)昆山,40 kHz,100 W),然后在下沉條件下用0.01 M磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)透析(MWCO 100 kDa)。游離FITC-IFN在0.01M磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中也作為對(duì)照進(jìn)行透析。當(dāng)對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的游離IFN去除后,使用FITC-IFN的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線,使用FITC-IFN的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線,通過Spectramax Gemini XS微孔板熒光計(jì)(分子器件合作,美國(guó)加利福尼亞州桑尼維爾)測(cè)量外透析液中FITC-IFN的量,然后從添加的FITC-IFN總量中減去該值以計(jì)算FITC-IFN的負(fù)載量。載藥量計(jì)算為FITC-IFN對(duì)聚合物的質(zhì)量百分比。


使用JEOL JEM-1400透射電子顯微鏡在100 kV的工作電壓下觀察成型膠束的形貌(JEOL,日本東京)。使用Zetasizer Nano ZS90(英國(guó)伍斯特郡馬爾文儀器有限公司)在25°C下記錄聚合物和膠束的粒徑和zeta電位。測(cè)試前使用0.01 M磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)將溶液稀釋至1 mg-mL-1。


2.4.pH 敏感釋放從膠束
將裝有FITC-IFN的膠束溶液(5 mL)轉(zhuǎn)移到透析袋(MWCO 100 kDa)中,然后將袋子放入150 mL的0.02 M磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)、0.02 M HAc-NaAc緩沖液(pH 5.5)或0.02 M HAc-NaAc緩沖液(pH 4.5)中。聚合物/FITC-IFN配合溶液的制備如第2.3節(jié)所述。以預(yù)定的時(shí)間間隔,抽出給定體積的釋放培養(yǎng)基并補(bǔ)充等體積的新鮮緩沖溶液。用微孔板熒光計(jì)測(cè)定IFN的釋放量,計(jì)算藥物的累積釋放量,并繪制藥物釋放的百分比與時(shí)間的關(guān)系圖。所有實(shí)驗(yàn)一式兩份進(jìn)行。


2.5.最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)量
采用肉湯微量稀釋法研究了聚合物對(duì)革蘭氏陽性MRSA和革蘭氏陰性銅綠假單胞菌的抗菌活性。將細(xì)菌細(xì)胞在37°C的Mueller Hinton肉湯(MHB)培養(yǎng)基中以300rpm不斷振蕩以達(dá)到中期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段。將微生物懸浮液稀釋并調(diào)節(jié)至2 X 105菌落形成單位(CFU)-mL-1。使用MHB對(duì)聚合物進(jìn)行一系列兩倍稀釋,細(xì)菌濃度范圍為60至0.2^M。將每種稀釋的聚合物溶液共50個(gè)加入到96孔微孔板中,然后加入50 rL細(xì)菌懸浮液,得到1 X 105 CFU-mL-1的最終接種物。在37°C孵育18小時(shí)后,用酶標(biāo)儀(Synergy HT, BioTek Instruments Inc.,Winooski,VT,美國(guó))。未添加聚合物處理的細(xì)菌細(xì)胞和未添加細(xì)菌的聚合物溶液分別用作陽性和陰性對(duì)照。MIC被定義為18小時(shí)后抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的濃度。


2.6.溶血測(cè)定
新鮮小鼠血液用K2EDTA處理,用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌3次,然后以1000g離心10分鐘以分離紅細(xì)胞。然后,獲得紅細(xì)胞并用PBS(pH 7.4)稀釋至終濃度為5%(v / v)。將50 rL不同濃度的聚合物溶液與等體積的紅細(xì)胞懸浮液在96孔微孔板上混合,然后孵育1hat37°C。 以1000X g 離心10分鐘后,將上清液的等分試樣(30RL)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)96孔微孔板中,并用100RL的PBS稀釋。


通過使用Biotek Synergy TH酶標(biāo)儀在540nm處測(cè)量吸光度來監(jiān)測(cè)紅細(xì)胞懸浮液中血紅蛋白的釋放。用2%Triton X-100裂解的紅細(xì)胞的吸光度用作陽性對(duì)照,并采取100%溶血,而PBS溶液中未經(jīng)處理的紅細(xì)胞懸浮液用作陰性對(duì)照。同時(shí),應(yīng)用聚合物溶液對(duì)照樣品排除聚合物吸收干擾(假陽性結(jié)果),并根據(jù)報(bào)告的方法檢查是否存在假陰性結(jié)果[32]。每次測(cè)試重復(fù)三次。根據(jù)以下公式(1)計(jì)算溶血百分比:
溶血 (%)=[(久樣品 — A 陰性)/0 陽性 — 久陰性)] X 100% (1) 其中 A 樣品代表處理樣品的吸光度,^陰性代表陰性對(duì)照的吸光度,A陽性代表陽性對(duì)照的吸光度。


本研究中的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行,并得到汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)(SUMC2016-200,2016年12月5日)的批準(zhǔn)。


2.7.微生物的成像研究
使用類似于MIC測(cè)定的方案在2X MIC下生長(zhǎng)并與聚合物混合細(xì)菌細(xì)胞。在37°C孵育90分鐘后,收集細(xì)菌細(xì)胞,用PBS(5000X g,10分鐘)洗滌兩次,并在4°C下用等體積的2.5%戊二醛溶液固定4小時(shí)。 將細(xì)菌細(xì)胞在0.1M PBS(5000X g,10分鐘)中沖洗,并進(jìn)一步固定在1%鋨酸(4°C中2小時(shí))。在0.1M PBS中沖洗后,通過分級(jí)系列乙醇(30-100%)使細(xì)胞脫水。


為了通過場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)觀察,將脫水樣品轉(zhuǎn)移到乙醇和乙酸異戊酯的1:1混合物中30分鐘,然后轉(zhuǎn)移到絕對(duì)乙酸異戊酯中1 h。對(duì)樣品進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥,濺射涂覆一層薄薄的金,并用FE-SEM(SU8010;日立,東京,日本)。
為了通過透射電子顯微鏡(TEM)觀察,將脫水樣品轉(zhuǎn)移到丙酮中20 min,轉(zhuǎn)移到丙酮和Spurr樹脂的1:1混合物中1 h,然后轉(zhuǎn)移到樹脂和無水丙酮的3:1混合物中3 h。最后,將樣品轉(zhuǎn)移到Spurr樹脂中并孵育過夜。獲得厚度為70-90nm的切片,并在TEM設(shè)置下進(jìn)行TEM觀察之前用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色10分鐘(H-7650,日立,東京,日本)。

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